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做原代细胞实验,分离提取方法及注意事项

2023-03-08 10:27:46
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  原代细胞是直接取自活组织(例如活组织检查材料)的细胞,并建立用于体外生长。这些细胞经历了非常少的群体倍增,因此与连续(肿瘤或人工永生化)细胞系相比,它们更能代表它们所衍生组织的主要功能成分,使得原代细胞成为更具代表性的体内模型。

  原代细胞分离是指将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程,获得高纯度、高活性的原代细胞则是很多细胞实验成功的关键要素之一,原代细胞分离的方法有很多种:悬浮离心法、直接组织块法、酶消化法、非酶消化法、机械分散法等。

  人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即使采用1mm3 的组织块,也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长,若需获取大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采用的方法如下:

  一、悬浮细胞的分离方法

  组织材料若来自血液、 羊水、胸水或腹水的悬液材料, 最简单的方法是采用 1000r/min 的低速离心 10 分钟,若悬液量大,可适当延长离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以避免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁 PBS 洗两次,用培养基洗一次后,调整适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采用离心后的细胞分层液,因为,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层,这样可根据需要收获目的细胞。

  二、实体组织材料的分离方法

  对于实体组织材料,由于细胞间结合紧密,为了使组织中的细胞充分分散,形成细胞悬液,可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。

  (一)机械分散法

  所取材料若纤维成分很少,如脑组织,部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头压出,或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

  (二)消化分离法

  组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状),应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动,使团块膨松,由块状变成絮状,此时再采用机械法,用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡,使细胞团块得以较充分的分散,制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液,接种培养后,细胞容易贴壁生长。

  消化分离法的操作步骤

  1)剪切把组织块剪碎,呈 1~5mm3 大小的组织块。

  2) 加液漂洗 将碎组织块在平皿(或三角烧瓶)中用无钙镁 PBS 洗 2-3 次(采用倾斜,自然沉降法)。

  3)消化 加入消化液 (胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA )于 37℃水浴中作用适当时间 (中间可轻摇 1~2 次),若组织块膨松呈絮状可终止,若变化不大可更换一次消化液,继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。

  4)弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

  5)漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入,中止消化反应,采用漂洗法洗 2-3 次后,加入完全培养基。

  6)机械分散 采用吸管吹打或振荡法,使细胞充分散开后用纱网或 3~4 层无菌纱布过滤后分瓶培养,若要求不高可采用倾斜自然沉降 5~10 分钟,吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

  注意事项如下

  1)组织块必须漂洗 2-3 次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

  2)胰蛋白浓度不宜过高,作用时间不能太长,以避免毒性作用。

  3)消化后组织不仅要尽量弃去消化液,以避免毒性产生,而且动作要轻,以避免膨松的细胞随漂洗而丢失

  三、酶消化法

  1)无菌

  确保使用无菌设备、试剂和技术收集和处理组织。使用个人防护设备以避免污染。使用0.22微米的膜无菌过滤所有酶和试剂。

  2)切块

  用无菌剪刀或手术刀将组织标本切成小块(通常为2×4mm),然后将小块放入选定的缓冲液、培养基或盐溶液中。

  3)加酶

  将组织清洗三次以消除多余的血液蛋白,然后加入您选择的酶如胶原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常,约0.5 mg/ml~1.5mg/ml的酶。

  4)孵育

  将组织样本在其最佳温度下孵育,通常在37℃下孵育30~90分钟。定期混合或轻轻摇动标本。

  5)洗涤

  通过轻轻移液来分散细胞(也称为研磨),然后,使用细网过滤细胞悬浮液。让细胞沉淀并滗出多余的含液酶;洗两到三次。含有FBS,BSA或其他抑制剂的洗涤溶液也可用于阻止酶消化。

  6)分析

  将细胞重悬于正确的培养基或缓冲液中,然后定量测定细胞产量和活力。这是细胞分离过程中的重要步骤,因此您可以评估解离技术的结果。大多数研究人员使用血细胞计数器测定细胞产量,并使用台盼蓝重氮染料测量细胞活力。

  7)培养

  这个适合,就可以根据所分离的细胞来选择最适合研究的方案和处理步骤来培养细胞了。

  重点注意事项

  1)使用细胞分离酶时,请注意温度和湿度条件。如蛋白水解酶可以自动分解,因此建议在使用前立即将其溶解,并在冰上保存2℃~8℃。

  2)通常用于细胞分离的大多数酶可以直接溶解于平衡盐溶液或所选缓冲液中。对于许多细胞分离中,确保解离期间的组织存活,需要孵育培养基充分氧化并在生理pH下缓冲。95%O2、5%CO2平衡的介质来完成。

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