一、MTT法

【原理】

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将MTT（四唑盐）还原为不溶于水的蓝紫色甲臜（Formazan），死细胞无此功能。溶解甲臜后，通过吸光度（570nm）间接反映活细胞数量。

【步骤】

1. 细胞接种于96孔板培养

2. 加入MTT溶液孵育4小时

3. 弃上清，加入DMSO溶解甲臜，多振荡

4. 酶标仪检测吸光度

【优点】

1. 成本低，操作简单，适用于大规模筛选

2. 适用于药物筛选和细胞毒性实验

【缺点】

1. 甲臜不溶于水，需溶解，步骤繁琐，弃液可能导致细胞损失

2. MTT有细胞毒性，无法进行连续检测

3. 受细胞数量和代谢状态影响大

【注意事项】

1. MTT需现配或分装冻存，操作时需避光

2. 贴壁细胞需确保甲臜完全溶解，悬浮细胞需离心后弃上清

3. 避免孔边缘效应，四周孔不用于检测

4. 设置空白对照和药物对照

【应用场景】

1. 药物筛选

2. 细胞增殖动力学研究

3. 贴壁细胞毒性实验

4. 细胞活性初步评估

二、CCK-8（WST-8）法

【原理】

水溶性四唑盐WST-8在电子耦合试剂存在下，被活细胞线粒体脱氢酶还原为水溶性黄色甲臜，吸光度（450nm）与活细胞数正相关。

【步骤】

1. 细胞接种后，直接向培养板加入CCK-8溶液

2. 37°孵育1~4小时

3. 酶标仪检测吸光度

【优点】

1. 水溶性，无需溶解换液步骤，操作简便

2. 毒性低，可用于连续检测

3. 灵敏度高，适用于高通量筛选

【缺点】

1. 试剂成本较高

2. 易受酚红和血清干扰（需设对照校正）

【注意事项】

1. 避免反复冻融，4℃避光保存

2. 避免培养基血清干扰，血清浓度高于10%需做空白对照

3. 显色后尽快读数，避免长时间放置影响结果

【应用场景】

1. 细胞增殖/毒性动态监测

2. 药物效价分析

3. 细胞活力定量检测

三、XTT法

【原理】

XTT被活细胞线粒体脱氢酶还原为水溶性橙黄色甲臜，需电子偶联剂（如PMS）增强反应效率，吸光度（450nm）反映活细胞数。

【步骤】

1. 细胞接种于96孔板培养

2. 配制XTT和PMS混合液（现配现用，避光）

3. 加入培养孔孵育1~4小时

4. 酶标仪检测吸光度

【优点】

1. 水溶性甲臜无需溶解，操作简便

2. 灵敏度高，适用于高通量和连续监测

【缺点】

1. XTT溶液稳定性差，需避光保存

2. 混合液需现配现用，易氧化失效

3. 孵育时间需优化，易受还原性物质干扰

【注意事项】

1. XTT和PMS对光敏感，避免长时间暴露于强光

2. 避免NaN3等代谢抑制剂

3. 确保细胞培养液无菌、无支原体污染

【应用场景】

1. 抗癌药物筛选

2. 细胞代谢活性研究

四、ATP生物发光法（CTG法）

【原理】

活细胞内的ATP含量与细胞活性正相关，ATP与荧光素酶反应产生光信号，发光强度与ATP浓度（即活细胞数）正相关。

【步骤】

1. 加入细胞裂解液破坏细胞膜释放ATP

2. 混合荧光素酶试剂

3. 检测发光强度

【优点】

1. 灵敏度极高（可检测10个活细胞）

2. 操作快速（比MTT快20倍），适合高通量筛选

【缺点】

1. 试剂昂贵

2. 无法区分细胞类型，仅反映总活性

3. 需避光操作，仪器要求高

4. TP易降解，需新鲜样本立即检测

【注意事项】

1. 样本需冰上操作，避免ATP酶降解ATP

2. 避免ATP污染和试剂反复冻融

3. 使用白色/黑色孔板减少信号干扰

【应用场景】

1. 生物制药污染检测（如支原体）

2. 细胞库活力质控

3. 高通量药物筛选

五、台盼蓝染色法

【原理】

死细胞膜破损被台盼蓝染色（蓝色），活细胞拒染（透明），通过显微镜计数区分死活细胞。

【步骤】

1. 细胞悬液与台盼蓝混合

2. 显微镜下计数活/死细胞

【优点】

1. 操作快速简便，成本低

2. 适合单细胞悬液的实时检测

【缺点】

1. 主观性强，无法检测早期凋亡

2. 灵敏度低，仅适用于粗略评估

3. 人工计数误差大，不适用于高通量

【注意事项】

1. 染色时间控制在3~5分钟，避免假阳性和活细胞受损

2. 细胞浓度适中，避免细胞重叠

3. 计数时需重复3次取平均值

【应用场景】

1. 细胞传代

2. 冻存复苏后存活率评估

3. 原代细胞分离效果检测

六、荧光法（如Alamar Blue）

【原理】

活细胞代谢还原Alamar Blue产生荧光/颜色变化（激发530nm发射590nm）。

【步骤】

1. 加入染料孵育

2. 检测荧光强度

【优点】

1. 非破坏性，可连续监测细胞

2. 灵敏度高

【缺点】

1. 需无酚红培养基

2. 对培养时间敏感

【应用场景】

1. 细胞活性检测

2. 细胞毒性检测

3. 细胞增殖检测

4. 叠加检测

七、流式细胞术（Flow Cytometry）

【原理】

利用荧光染料（如Annexin V-FITC/P、Calcein-AM/PI）标记细胞，通过流式细胞仪检测荧光信号，区分活细胞（Calcein-AM绿色）、早期凋亡细胞（AnnexinV+）和死细胞（PI红色）。

【步骤】

1. 细胞处理后，收集单细胞悬液，PBS洗涤

2. 加入荧光染料，室温避光孵育15~20分钟

3. 流式细胞仪检测，分析各荧光通道细胞比例

【优点】

1. 定量精确，可同时检测多参数（如凋亡、周期）

2. 适合复杂样本（如组织消化液、血液细胞）

【缺点】

1. 需要昂贵设备和专业操作技能

2. 染料成本高，样本制备需严格避免细胞聚集

【注意事项】

1. 染料浓度需预实验优化，避免非特异性染色

2. 避免剧烈吹打细胞，防止机械损伤

3. 样本需在1小时内检测，避免荧光衰减

【应用场景】

1. 细胞凋亡/坏死机制研究

2. 免疫细胞活性分析

3. 干细胞质量控制

八、LDH法

【原理】

检测细胞膜破损后释放的乳酸脱氢酶（LDH），通过催化反应生成红色甲臜（吸光度492nm）。

【步骤】

1. 收集培养基上清液

2. 加入LDH底物孵育

3. 酶标仪检测吸光度

【优点】

1. 检测细胞膜破损，直接反映细胞膜完整性

2. 无需裂解细胞，直接检测上清液，操作简便

3. 反应时间短，适用于高通量毒性筛选

【缺点】

1. 无法区分活细胞数量，需结合其他方法（如CCK-8）评估总细胞活性

2. 易受污染，培养基中若含血清，需用无血清培养基或扣除背景值（血清中可能含少量LDH）

3. 仅反映晚期细胞死亡，无法检测早期凋亡或可逆损伤

【注意事项】

1. 避免反复冻融，细胞裂解液或上清液冻融会导致LDH释放，影响结果准确性

2. 设置无细胞对照以排除背景干扰

3. LDH在室温下稳定性有限，上清液收集后应尽快检测

【应用场景】

1. 细胞膜完整性检测

2. 高通量毒性筛选

3. 细胞毒性实验