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简述基因克隆的基本步骤(基因克隆原理与实验方案)

发布时间:2021-12-04 10:54:27 阅读:14322次 来源:生物在线

  基因克隆技术,又称重组 DNA 技术,是将 目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组,获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白,以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

  1. 基因克隆操作流程

  收集基因信息——>设计引物——>PCR ——>回收目的片段——>与载体

  连接,取得连接产物 ——> 用感受态细胞做转化 ——>接菌——>阳性克隆鉴

  定(酶切法或PCR)——>质粒抽提——>质粒测序——>测序结果分析——>克隆

  信息输入数据库——>质粒实物保存

  2. 基因克隆方法

  2.1 设计引物

  引物设计要求:引物长度为25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm

  为70℃(±4℃),且两条引物的Tm 相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形

  成稳定的二聚体或发夹结构,引物与模板不能有任何错配。

  forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC

  reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC

  2.2 PCR

  2.2.1 PCR 反应体系

  模扳(100ng/ul 质粒) 2.00μl

  4dNTP(10mM) 1.00μl

  10×PCR Buffer 5.00μl

  MgCl2(25mM) 5.00μl

  5’Primer (10-12uM) 4.00μl

  3’Primer (10-12uM) 4.00μl

  5M 甜菜碱 10.00μl

  Pfu (5U/ul) 0.50μl

  ddH20 18.50μl

  总计 50.00μl

  2.2.2 PCR 反应程序

  1)从cDNA 文库克隆基因

  Stage1 Stage2 Stage3

  1 Cycle 30Cycle 1 Cycle

  95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

  2min 30sec 30 sec

  Xmin(2

  min/Kb)

  10min 1min

  注:Pfu 酶最适延伸温度为68℃。

  2)从含目的基因质粒中克隆

  Stage1 Stage2 Stage3

  1 Cycle 22Cycle 1 Cycle

  95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

  2min 30sec 30 sec

  Xmin(2

  min/Kb)

  10min 1min

  2.3 割胶回收目的片段

  (QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)

  1) 1%Agarose 胶电泳将目的DNA 片段用干净的手术刀割下,放入1.5ml 离心管

  2) 称重后,在1.5ml 离心管中加入3 倍胶体积的buffer QG(100mg 加300ul)

  3) 50℃水浴中放置10min(至胶完全溶解),每2-3 分钟混匀一次(溶胶液应于

  buffer QG 颜色相同)

  4) 加入1 倍胶体积的异丙醇然后充分混匀,静置片刻。

  5) 将样品转移入柱子中(柱子的最大容量为800uL),然后13000rpm*1min 离心

  6) 取下柱子,弃流出液,将柱子放回到刚才那个收集管中

  7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子,室温放置2-5min,然后13000rpm*1min 离心

  8) 取下柱子,弃流出液,再次13000rpm*1min 离心

  9) 将柱子放置在一支新的1.5mL 离心管中,加入50uL EB buffer (或无菌H2O)

  至膜中央,静置片刻,然后13000rpm*1min 离心,然后测定浓度

细胞皿

  2.4 连 接

  在连接反应中通常要求: (目的基因分子数:载体分子数=3:1)

  连接反应体系

  sample + -

  10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl

  PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl

  目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /

  T4 连接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl

  补水 6.50μl 6.50μl 7.50μl

  于16℃连接过夜。或室温(25℃)1 小时以上。

  2.5 感受态细胞制备及转化

  2.5.1 CaCl2 制备感受态细胞(DH5α 、DH10B、TOP10 )

  1) 接过夜菌 在15ml 试管中加入3ml LB 培养基,从平板上挑取一单克隆接

  种,37℃,260rpm,培养过夜,约16 小时。

  2) 接菌 取2ml 过夜菌接入200ml 新鲜的LB 培养基, 37℃,260rpm,培

  养,直至OD600=0.4-0.5(一般约2 小时),然后将菌液冰浴30-60 分钟。

  3) 收菌 4℃,5000rpm×5min,弃上清。

  4) CaCl2 悬浮 若50ml 菌液收菌,用10ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打,充分悬

  浮,冰浴10min。

  5)离心 4℃,5000rpm×5min,弃上清。

  6)CaCl2 悬浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 轻轻吹打,充分悬浮,冰浴30min 即感

  受态制备完成。

  此时感受态可直接使用或冰浴过夜第二天使用或加入10%的灭菌甘油,混匀后

  -80℃冻存,以后使用(一般可存1 个月)。

  注: 制备感受态细胞要求严格控制温度,制备过程在冰上操作。

  2.5.2 转化(PGEM-T vector)

  1) 准备1.5ml 的离心管,冰浴预冷。

  2) 取100ul 感受态细胞,加入5ul 连接液,冰浴45-60min。

  3) 42℃热刺激90sec。(此关键步骤,一定注意温度及时间)

  4) 冰浴2min。

  5) 加LB 培养基900ul,37℃,150rpm 培养45-60min。

  6) 4000rpm×3min 离心。

  7) 留100ul 上清,弃多余部分,混匀,涂布到含氨苄青霉素的LB 板(预先涂

  布X-gal 和IPTG)。

  8) 37℃ 培养箱倒置培养过夜,约16 小时。

  2.6 接菌

  1) 转化得到蓝白菌落筛选板 (因为我们一般用的是PGEM-T 做连接,经X-gal

  处理后,有插入片段的显白色;载体自连的显蓝色,因此得到筛选。)

  2) 挑取白色的菌落接到含氨苄青霉素的LB 培养基。

  3) 37℃,260rpm 培养。

  4) 培养5-6 小时后挑取2ul 菌液为模板做PCR 鉴定。

  5) 以PCR 结果,将有目的片段插入的样品以5ml LB 培养基再次接菌,37℃,

  260rpm 培养过夜,约16 小时。

  2.7 阳性克隆鉴定 (PCR 鉴定)

  2.7.1PCR 鉴定体系

  10X Taq buffer 3 ul

  4X dNTP (10mM) 0.5 ul

  Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)

  10uM引物 (双向) 各1ul

  50%DMSO(which is optional) 1ul

  模板:过夜菌液 / 挑单克隆 2ul

  加灭菌水至 30ul

  2.7.2 PCR 鉴定程序:

  94℃ 5min

  94℃ 30s

  30cycle 55℃ 30s

  72℃ 3min

  72℃ 10min

  4℃ +∞

  30ul 上样,走电泳(以100bp plus marker 为对照)→核对片断大小

  2.8 质粒抽提 (质粒小量抽提试剂盒)

  1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)

  2) 弃上清。

  3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A),涡旋振荡,使菌体充分悬浮。

  4) 加200ul Solution II,温和混匀6 次。(此过程不超过5min)

  5) 加280ul Solution III,温和混匀6 次。

  6) 以14000 rpm×10 min 离心。

  7) 取上清,过吸附柱,以10000 rpm×1 min,弃滤液。

  8) 吸附柱内加450ul Buffer2,10000 rpm×1 min,弃滤液。

  9) 反复步骤8)一次。

  10) 14000 rpm×1 min 离心。

  11) 将吸附柱旋转180 度后再14000 rpm×1 min 离心。

  12) 加40ul 50℃预热的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央,室温静置

  2min。

  13) 14000 rpm×1 min 离心并收集洗脱液,即质粒DNA。

  2.9 测 序

  1) ABI377 测序仪测序。

  2) 测序结果分析:用软件Vector NTI Suite 6 分析测序结果。每个克隆相应的测

  序结果,分析结果,存储信息分类输入数据库http://192.168.0.2/index.htm。

  克隆信息管理系统。将测序完成的克隆编号入库。

  基因克隆的编码

  根据实验基因引物的号码相对应编制。

  如:基因引物编号: 1000_f 1000_r

  克隆编号: 1000A1 or 100092

  (注:号码倒数第二位为日期编号: 1—9 为阿拉伯数字 10=A,11=B,12=C…

  最后一位为克隆数编号,一般为1—3)

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/527.html

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