在分子生物学研究领域，实时荧光定量逆转录 PCR（qRT-PCR）是检测基因表达水平的 “黄金标准”，但面对一步法和两步法这两种技术路线，许多科研新手甚至经验丰富的研究者都难免陷入 “选择困难症”。

今天就带大家深入剖析两种方法的核心差异，手把手教你选出最适合的实验方案！

一、一步法VS.两步法

1．实验流程差异

2．性能参数对比

3．优势与劣势

4．应用场景首选推荐

一步法：

l 高通量筛查：如临床样本中病毒RNA的快速检测（如新冠病毒、流感病毒）

l 稳定表达基因分析：需多次重复检测同一基因时（如内参基因验证或已知靶标的表达稳定性研究）

l 资源有限的环境：实验室设备或时间受限时，一步法可简化操作流程

两步法：

l 多基因表达分析：如同一RNA样本需检测多个靶基因

l 科研探索性实验：需灵活调整反应条件或验证新靶点

l 长期保存cDNA库：如后续需重复实验或扩大检测范围

二、影响qRT-PCR结果的因素

1．RNA质量与样本处理

（1）RNA纯度与完整性：降解或含抑制物的RNA会显著影响反转录效率及后续扩增

（2）基因组DNA残留：需设置“无逆转录酶对照”验证是否残留DNA，并通过设计跨外显子接合点的引物避免基因组DNA扩增

2．反应体系与条件优化

（1）预混液与均一化：使用预混液（含R0X参比荧光）可减少孔间差异，提高重复性。内参基因需在样本中表达稳定，用于校正样本间误差

（2）扩增条件：退火温度（需根据引物Tm值调整，过高导致扩增失败，过低增加非特异性产物）；循环参数（避免过早进入平台期，基线设置应在指数扩增阶段前2个循环，阈值线需覆盖至少10倍标准差范围）

（3）抑制物与污染控制：抑制物（如酚类、肝素）可通过稀释样本或优化提取步骤除去。实验区域需定期用DNA去污染试剂处理，并设置无模板对照排除污染

3．引物与探针设计

（1）特异性：引物需通过软件设计，避免二聚体、发夹结构及非靶序列结合；探针需优化熔解温度（Tm值）

（2）扩增效率：引物对扩增效率应在90%~110%（斜率3.1~3.6），可通过标准曲线验证

（3）跨外显子设计：真核样本引物应跨越外显子接合点，避免基因组DNA扩增

4．反应体系与条件优化

（1）内参基因选择：需选择表达稳定的内参（如18SrRNA优于Bactin/GAPDH），用于校正样本间RNA提取差异

（2）标准曲线与Ct值解读：标准曲线范围需覆盖目标基因丰度，Ct值有效区间为15~35，过高提示模板量不足或抑制物存在，过低可能为污染或非特异性扩增

5．仪器与操作规范

（1）仪器校准：PCR仪需定期校准，确保荧光检测灵敏度一致，避免通道间差异

（2）操作误差：加样需精准，建议使用非接触式移液系统减少人为误差。反应管需充分混匀并避免气泡