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流式细胞仪工作原理及临床应用

发布时间:2022-05-14 10:13:04 阅读:12912次 来源:百度学术

  流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪,到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台。

  FCM采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析,通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术,具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点,还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着该仪器性能的不断完善,操作简单的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不断发现使试验费用日益降低,FCM也从研究室逐步进入临床实验室,成为常规实验诊断的重要手段,不仅为临床提供了重要的诊断依据,也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。

  一、流式细胞仪工作原理

  生产流式细胞仪的主要厂家是美国的BD公司和贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)两家公司,它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪,并研制生产了FCM所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。科研型流式细胞仪(如FACStar, FACSort, EPICS-Elite等)功能齐全,分析灵活,但操作比较繁琐,必须由经过正规培训的专业技术人员进行操作。临床型的仪器(FACScan, Profile等)易于操作,稳定性好,分析速度快,适合在临床实验室中应用。

  流式细胞仪的工作原理是将待测细胞经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱,后者与入射的激光束垂直相交,液柱中的细胞被激光激发产生荧光。仪器中一系列光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集荧光、光散射、光吸收或细胞电阻抗等信号,计算机系统进行收集、储存、显示并分析被测定的各种信号,对各种指标做出统计分析[1,2]。

  科研型流式细胞仪还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,以便对它们进行进一步的研究分析。其分选原理是把液滴形成的信号加在压电晶体上使之产生机械振动,流动室即随之振动,使液柱断列成一连串均匀的液滴,一部分液滴中包有细胞,而细胞性质是在进入液滴以前已经被测定了的,如果其特征与被选定要进行分选的细胞特征相符,则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷,使被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,而未被选定细胞形成的细胞液滴和不包含细胞的空白液滴不被充电。带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷符号向左或向右偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。对分选出的细胞可以进行培养或其它处理,做更深的研究。

  二、流式细胞术的临床应用

  随着对FCM研究的日益深入,其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段,在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。

  1.在肿瘤学中的应用:这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1期,S期和G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。(1)发现癌前病变,协助肿瘤早期诊断:人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程,而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时,在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变,FCM可精确定量DNA含量的改变,作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志,能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价,有助于癌变的早期诊断。有资料证实,癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系,增生程度越重,癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重,DNA非整倍体出现率增高,这是癌变的一个重要标志。(2)在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用:FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可,DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据,FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大,敏感度高等优点,已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用,异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。

  FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳的治疗方案,从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物,对瘤细胞达到最大的杀伤效果。

  此外FCM近几年还被应用于细胞凋亡和多药耐药基因的研究中[3,4]。医学工作者开始研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因,FCM对多药耐药基因(P170等)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定,可为临床治疗效果分析提供有力依据。

  2.在临床细胞免疫中的作用:FCM通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析,进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。有大量文章介绍了淋巴细胞亚群等在各种疾病中的变化。正常人群淋巴细胞T4/T8比值大约为2∶1,但在人体细胞免疫力低下时可出现比例倒置。用FCM还可以监测肾移植后病人的肾排斥反应,如果T4/T8比例倒置,病人预后良好,较少发生肾排异现象;反之排异危险性增加。同样此种测定技术也用于爱滋病的诊断和治疗中。还有作者报告了外周血淋巴细胞免疫表型的参考值,并对其种族、性别、年龄等影响因素进行了探讨[5]。

  目前FCM用的各种单克隆抗体试剂已经发展到了百余种,可以对各种血细胞和组织细胞的表型进行测定分析。

  3.在血液病诊断和治疗中的应用:FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析,对各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。(1)白血病的诊断和治疗:FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原(CD)的单克隆抗体,借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素FITC,藻红蛋白PE等)测定一个细胞的多种参数,以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原,当形态学检查难以区别时,免疫表型参数对各种急性白血病的诊断和鉴别诊断有决定性作用[6]。例如干细胞表达CD34,髓系表达CD13、CD14,B细胞系表达CD10、CD19、CD20等,T细胞系表达CD2、CD3、CD5、CD7,利用FCM可以测定出血细胞表达各种抗原的水平,协助临床确诊。

  同其它肿瘤的治疗一样,测定DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗有一定作用,不同的白血病患者或同一患者在不同病期白血病细胞增殖状况不同,定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。

  目前临床除化疗药物治疗外还采用造血干细胞移植技术治疗急性白血病和一些疑难性疾病[7]。FCM通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体。造血干细胞移植技术主要包括干细胞的鉴别、活性测定、干细胞动员和采集、分离纯化、保存扩增、肿瘤细胞的净化、干细胞回输以及术后保持移植物抗宿主病的低发生率等一系列过程。FCM测定CD34、HLA-DR、CD33等细胞表面标志物,成为干细胞移植技术重要的监测手段。用FCM检测一系列指标观察病人的恢复状态,可以对预后做出早期的判断。(2)其它种类血液病的诊断和治疗监测:阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病,细胞CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族,是重要的补体调节蛋白,它通过与补体C8、C9的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成,从而抑制细胞被补体激活溶解。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞CD59的表达做定量分析,可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度[8]。(3)网织红细胞的测定及临床应用:网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标,FCM通过某些荧光染料(吖啶橙、噻唑橙等)与红细胞中RNA结合,定量测定网织红细胞中RNA,得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高[9]。此外FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度,对红细胞增殖能力的判断很有意义[10]。为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。

  4.在血栓与出血性疾病中的应用:(1)血小板功能的测定:正常情况下血小板以分散状态在血管内运行,但当血管损伤、血流改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断,FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段[11]。该方法灵敏、特异性高。如果采用全血法测定,只需微量标本,适合于儿童及血小板减少性疾病的患者[12]。

  血小板活化时其质膜糖蛋白较其静止期发生显著改变,FCM可以通过单抗免疫荧光标记(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62,CD63等)监测血小板功能及活化情况,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗。

  此外血小板活化时其细胞内的钙离子浓度发生很大变化,借助于钙离子敏感荧光探针的帮助,用FCM测定钙离子浓度,可以作为活化血小板监测的非免疫性指标。(2)血小板相关抗体的测定:免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,其分子可以是IgG、IgA或IgM,用羊抗人IgG、IgA、IgM荧光抗体标记被测血小板,FCM可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面的相关抗体,间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测,具有检测速度快、灵敏度高的优点。

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