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除悬浮细胞中的死细胞怎么去除,去除悬浮细胞中的死细胞操作指南

2023-03-08 10:26:17
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  相信很多科研小伙伴在培养悬浮细胞中会遇到死亡细胞,那么如何有效去除悬浮细胞培养中死细胞呢,可以试试磁珠标记、.流式分选、活细胞短暂贴壁法、沉降法、低速离心法等方法

  我们知道在悬浮细胞的培养过程中,根据整体细胞生长分裂的状况可以将整个细胞培养周期分为四个时期:潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期。细胞进入对数生长期的时候是分裂最旺盛的时候,活性也是最高,随着分裂次数的增加,代谢产物增加,度增大,到了对数生长期后期有一小部分细胞会出现凋亡的迹象。

  进入稳定期后细胞密度达到最大,如果这个时候不及时补充营养更换新鲜培养基的话凋亡的细胞就会越来越多,即死细胞越来越多。如果死细胞太多的话会影响降低整体细胞活性,同时也会抑制影响正常细胞的生长代谢。如果涉及药筛实验等,死细胞比例更会大幅增加,以下方法可以有效去除悬浮细胞中的死细胞。

  1.磁珠标记

  MACS(magnetic-activated cell sorting),原理就是用结合了磁珠的抗体去标记细胞,让目的细胞带上磁珠,也可以正向选择死细胞,通过磁场将结合了磁珠与没结合磁珠的细胞分离开来。MACS是细胞分选的重要手段,优点是细胞活性好,缺点就是能分选的细胞类型有限,且成本较高。

  2.流式分选

  FACS(fluorescence-activated cell sorting),也就是流式分选,与流式分析一致。利用荧光素标记不同的分子,通过调节合适的电压、补偿等,通过荧光将目的细胞与非目的细胞区分开来。

  3.活细胞短暂贴壁法

  可以用一种叫Con.A(刀豆球蛋白)来包被培养皿或培养瓶,悬浮细胞中的活细胞可短暂贴壁,此时弃去上清,一段时间后,细胞又可以重新悬浮。市面上有一些经过特殊处理的养贴壁细胞的培养瓶也可达到这种效果,但是建议使用之前根据所养的悬浮细胞生长状况测试一下分离效果。

  4.沉降法

  部分悬浮细胞如NK92成团生长,成团的细胞状态较好,单个细胞基本没有增殖能力,根据这一特性,便可以将细胞悬液收集在离心管中,注意动作要轻柔,不要将细胞团吹散,将离心管直立,观察离心管底出现“白雾”层时,可小心将上清去除,来收获状态良好的细胞团。

  5.低速离心法

  一般来说,悬浮细胞中的死细胞及细胞碎片的密度相对较低,此时,可以通过低速(500-800rpm)来去除一些上清中的死细胞,每次传代或换液进行此操作,使活细胞有生长优势,可以慢慢提高活细胞比例。

  悬浮细胞如何看活细胞还是死细胞

  活细胞在100倍下观察可以很明显看到细胞形态是圆润发亮的,死细胞很明显是呈现黑灰色的,状态不好的个别细胞是不够圆润。

  去除悬浮细胞中的死细胞操作指南

  【操作参考】

  一般可以通过低速(800rpm)来去除一些上清中的死细胞,每次传代或换液进行此操作,使活细胞有生长优势,可以慢慢提高活细胞比例。

  【操作参考】

  将培养瓶竖立放一段时间(50min左右),然后用吸管轻轻吸取上面1ml的细胞悬液,移入另一个新的已加培基的培养瓶中。或者ficoll分离,就像分离PBMC一样,先把细胞混匀,然后小心缓慢地把细胞加入到ficol中,1000g离心20分钟,收集位于ficoll和培养基之间的透明层,即为你的活细胞,这是在存在大量死亡细胞的时候采用,如果死亡细胞不是特别多的话,换液勤一点。

  【操作参考】

  可以试验一下以下方法:1稀释法。细胞稀释后还能增殖,会越来越多,而细胞碎片相应地会越来越少。2.自然沉降法。将细胞悬液移到离心管中,等细胞大部分下沉时,可将上液吸弃,再加入培养液悬浮细胞,此方法可反复使用,同时每次可显微镜下观察是否符合你的要求。


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