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生物体液中细胞外泌体分离方法介绍及优缺点对比

发布时间:2022-11-28 10:39:47 阅读:11952次 来源:百度学术

  在生物流体中发现的细胞外囊泡包括来自内体,多泡体的细胞外泌体(30 nm 至 150 nm)和来自质膜的微泡(150 nm 至 1000 nm)。目前已知有多种从生物体液中分离外泌体的方法出了使用高速离心机的离心分离法以外,还有色谱法、超滤过滤法、基于聚合物的沉淀和免疫分离法等。

  这些细胞外泌体分离方法提取的外泌体要警惕非外泌体颗粒污染,如凋亡小体、凋亡小囊泡、外泌体和脂蛋白,均会对获得的外泌体生物活性产生影响。另外,分离方法也会影响细胞外泌体的纯度和产量。如果要从培养基中分离外泌体,就要使用无血清培养基或无外泌体胎牛血清。

图例

  表 1。外泌体分离方法比较差速离心法:

  差速离心法仍是实验中常用的外泌体分离技术。

  主要步骤如下:

  1.使用离心机低速离心来去除细胞与细胞碎片

  2.而后增加转速通过离心来消除样本中较大的细胞囊泡

  3.再使用高速离心机进行高速离心,通过离心沉淀的方式提取外泌体。

  在这里,需要注意的是生物流体的粘度与分离的外泌体的纯度有较强的相关性。

  所以,对于高粘度的生物样品需要超速离心机进行较长时间的离心操作。

图例

  图 1.差速离心法密度梯度离心法

  这种方法将超速离心机的超速离心与蔗糖密度梯度相结合 。具体地说,密度梯度离心用于将外泌体与非囊泡颗粒(例如蛋白质和蛋白质/RNA 聚集体)分离。因此,该方法将囊泡与不同密度的颗粒分离。足够的离心时间比较重要,否则如果外泌体部分具有相似的密度,则仍可能在外泌体部分中发现污染颗粒。


  图 2.用于分离外泌体的纤毛多孔结构。该结构不会让大于 1 μm 的细胞和其他颗粒进入布线区域。一些较小的颗粒和细胞碎片尺寸排阻色谱分离法

  尺寸排阻色谱 (SEC) 用于根据尺寸而非分子量分离大分子。该技术应用了一种填充有多孔聚合物珠子的柱子,该珠子含有多个孔和隧道。分子根据它们的直径穿过珠子。小半径分子通过色谱柱的孔迁移需要更长的时间,而大分子从色谱柱中洗脱得较早。尺寸排阻色谱可以精确分离大分子和小分子。此外,该方法可以应用不同的洗脱溶液。与离心机离心方法相比,色谱分离具有较多的优势,因为通过色谱分离的外泌体不受剪切力的影响,避免了因剪切力所造成的囊泡结构改变。目前,SEC 是一种广泛接受的分离血液和尿液中存在的外泌体的技术。

  此外,SEC 方法与超滤相结合已用于分离和分析尿源性外泌体。此外,流场-流分馏结合紫外分析仪和光散射检测器已被应用于分析外泌体的大小和纯度。流场-流分馏结合抛物线和交叉流来分离外泌体。获得的外泌体已通过电子显微镜和质谱检测。

  过滤法

  超滤膜也可用于外泌体的分离。根据微泡的大小,使用超滤膜过滤的方法可以将外泌体与蛋白质和其他大分子分离。外泌体也可以通过多孔结构捕获它们来分离(图 2)。常见的过滤膜孔径为 0.8 µm、0.45 µm 或 0.22 µm,可用于收集大于 800 nm、400 nm 或 200 nm 的外泌体。比如微柱多孔硅纤毛结构一般用于分离 40-100 nm 外泌体。在初始步骤中,去除较大的囊泡。在接下来的步骤中,外泌体会群集中在过滤膜上。隔离步骤相对较短,但该方法需要用 PBS 缓冲液对硅结构进行预孵育。

  除标准过滤技术外,切向流过滤在有效分离外泌体方面也有着尝试应用,通过切向流过滤技术去除游离肽和其他小化合物从而分离具有确定大小的外泌体。此外,在体外研究和脂肪组织中,也会采用超滤与 SEC 的结合的方式来分离外泌体。

图例

  图 3.外泌体过滤的筛分模型。通过 (a) 对片上过滤器施加压力或 (b) 产生电场,迫使外泌体穿过多孔膜,结合错流和电泳分选 [来完成筛分。

  基于聚合物的沉淀法

  基于聚合物的沉淀技术通常包括将生物流体与含聚合物的沉淀溶液混合、4℃孵育和低速离心。用于基于聚合物的沉淀的较常见聚合物之一是聚乙二醇 (PEG)。这种聚合物的沉淀可以对分离的外泌体产生温和影响而且可以产生中性的 pH 值。由此,出现了几种常见的外泌体试剂盒:比如: System Biosciences, Mountain View, CA, ExoQuick™ 等。

  研究表明,使用 ExoQuick™ 方法可以快速执行,无需额外设备,只需用高速离心机进行超速离心可以获得高产量的外泌体。但是此方法的缺点是:非外泌体材料对外泌体分离物的污染仍然是基于聚合物的分离方法的一个问题。此外,分离物中的聚合物可能会干扰下游分析。

  免疫分离法:

  免疫芯片方法基于表面外泌体受体,用于根据来源分离外泌体。获得的外泌体可直接分析或用于 DNA 或总 RNA 分离 。外泌体胞内蛋白可用作分离外泌体的特异性标志物。此外,基于 ELISA 的 ExoTEST™ 也可以用于有效分离外泌体。其原理是:使用涂有外泌体抗体的ExoTEST™ 板,可以从各种生物体液中分离出外泌体。该方法适用于常见和细胞类型特异性外泌体蛋白的检测、分析和定量。

  筛分分离法:

  该技术是通过膜从生物液体中筛分外泌体并通过压力或电泳进行过滤来分离外泌体 (图 3)。筛分分离法的分离时间较短,但分离的外泌体纯度却处于较高的水平。筛分分离法的缺点在于分离的外泌体回收率较低。

  总之,细胞外泌体提取、外泌体分离在肿瘤等研究领域发挥着重要作用。细胞外泌体分离方法目前多数还是采用高速离心机 进行离心分离的技术方法,然而,其他几种分离技术,如过滤法、免疫分离法和筛分法,虽然也能进行外泌体分离,但每种方法都有其局限性,多数还是仅应用于实验室、科学研究等领域。


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