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HRP 化学发光 ELISA-肽检测实验步骤(HRP 化学发光 ELISA-P)

2022-05-26 10:38:57
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  A. 溶液与试剂

  碳酸盐缓冲液: 15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、0.2 g/l NaN3 (pH 9.6)。将 1 µM 合成肽加入碳酸盐缓冲液中。

  10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):要配制 1L,添加 80g 氯化钠 (NaCl)、2g 氯化钾 (KCl)、14.4g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4g 磷酸一氢钾 (KH2PO4) 到 1L dH2O 中。调节 pH 至 7.4。

  洗涤缓冲液:含有 0.05% Tween® 20 的 1 X PBS (PBST)

  封闭缓冲液:PBST 中 10 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA)

  一抗稀释缓冲液: 用 PBST 配制 1 mg/ml BSA

  二抗稀释缓冲液: 3% BSA 稀释于 PBST 中

  96-孔平板: 化学发光检测建议使用纯白或不透明的平板。

  B. 让肽结合 96 孔平板

  对于 96 孔微滴定平板的各孔,用通过碳酸盐缓冲液配制的 100 µl 1µM 合成肽包被,在 4°C 下孵育过夜,或在 37°C 下孵育 2-6 小时。如果肽不结合或不吸附,可尝试pH在4–8 内的其他缓冲液。

  平板按 200 µl/孔用洗涤缓冲液洗涤三次。

  在 37°C 下,平板按 200 µl/孔用封闭缓冲液封闭 1 小时。将洗涤缓冲液洗涤平板 3 次。(如果需要,可以持续 1-2 个月将平板保持在 4°C )

  C. HRP 偶联一抗的实验步骤

  使用一抗稀释缓冲液配制建议稀释度的 HRP 偶联一抗。向各孔添加 100μl,并在 37°C 孵育 1 小时。

  用洗涤缓冲液洗涤 5 次。

  通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution (# 7003) 和 Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。

  在添加底物后的 1–10 分钟内,使用平板光度计来测量在 425nM 处的相对光单位 (RLU)。

  在 10 分钟内读取以获得最佳信号强度。

  D. HRP 偶联二抗的实验步骤

  使用一抗稀释缓冲液配制建议稀释度的一抗溶液。向各孔添加 100 µl,并在 4°C 下孵育过夜,或在 37°C 下孵育 2-6 小时。

  用洗涤缓冲液洗涤 3 次。

  使用二抗稀释缓冲液配制建议稀释度的 HRP 偶联二抗。向各孔添加 100μl,并在 37°C 孵育 1 小时。

  用洗涤缓冲液洗涤 5 次。

  通过混合等量的 Luminol/Enhancer Solution (# 7003) 和 Stable Peroxide Buffer 来配制工作液。

  在添加底物后的 1–10 分钟内,使用平板光度计来测量在 425nM 处的相对光单位 (RLU)。

  在 10 分钟内读取以获得最佳信号强度。

  *建议的 HRP 偶联二抗:

  Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074

  Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076

  Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody #7077

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