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ELISA实验样本处理方法汇总,几种比较常规的样本类型处理方法

发布时间:2022-10-10 10:38:58 阅读:12442次 来源:百度学术

  常规用于ELISA实验的样本包含血清、血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异,合适的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里,我们将介绍几种比较常规的样本类型处理方法。

ELISA实验样本处理方法汇总,几种比较常规的样本类型处理方法

  1.血清

  血清是ELISA实验最常用的样本,其预处理也十分简单。

  ①使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜,分离出血清(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面,使血清可以更大程度地分离出来)。

  ②2-8℃下以1000×g离心20分钟,小心收集上清液(清),立即进行测定。

  ③若不立即检测,建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融。

  ④在收集血液样本的过程中应避免溶血,因为红细胞在溶解  时会释放具有过氧化物酶活性的物质,这种情况下,ELISA实验中将会出现非特异性显色反应,导致检测结果不准确。

  ⑤样本还应避免细菌污染,因为细菌可能含有内源性HRP,也会导致检测结果不准确。

  2.血浆

  ①使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30  分钟内,2-8℃下以1000×g离心15分钟,小心收集上清(血浆)。

  ②建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存,避免反  复冻融。

  ③样本应避免溶血或高血脂。

  ④常见的抗凝剂包括EDTA钠盐,肝素钠,枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书,查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

  3.细胞培养上清:

  ①将细胞培养上清液吸入离心管中,在2-8℃下以1000×g离心20分钟,除去细胞碎片和杂质,收集上清液备用,

  ②样本保存在-20℃或-80℃,避免反复冻融。

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  4.细胞裂解液

  反复冻融方法:

  ①吸出培养板中的培养基,用胰蛋白酶消化细胞,然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

  ②将细胞悬浮液收集到离心管中,在2-8℃下以1000×g离心  5分钟,然后吸去培养基,用预冷PBS洗涤细胞3次。

  ③加入适量的预冷PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制  剂)重悬细胞。在6孔培养板(约1×106个细胞)中,每个孔加入150-250μL的PBS来重悬细胞。

  ④使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融,重复  融过程数次,直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

  ⑤2-8℃下以1500×g离心10分钟,去除细胞碎片,收集上清液。

  ⑥-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

  5.组织匀浆

  ①用预冷的PBS(0.01M,PH7.4)冲洗组织以除去表面残留  的血液或杂质(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)。

  ②将组织块称重,然后切成尽可能小的碎块,以便充分匀浆。

  ③加入适量的预冷PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的  组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调 整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。

  ④将匀浆液吸入离心管中,2-8℃下以5000×g离心5分钟,收集上清液。

  ⑤保存至-20℃或-80℃,避免反复冻融。

  6.唾液

  ①在2-8℃下,4000×g离心10分钟以去除杂质,取上清即可检测。

  ②建议使用新鲜的唾液样本检测。

  7.尿液

  ①使用无菌容器收集尿液样本。

  ②在2-8℃下,1000×g离心15分钟以去除杂质,取上清即可检测。

  8.粪便

  ①将粪便样本用PBS(0.01M, pH=7.4)重悬,置于冰上振荡15  分钟。

  ②在2-8℃,5000×g离心5分钟,取上清即可检测

  注意事项:

  ①样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(3个月内检测),避免反复冻融。融化样本在试验前请再次离心以去除冻融后可能出现的沉淀物。

  ②试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围,如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释(建议查阅文献后先做预实验,以确定稀释倍数)。

  ③若所检样本不在说明书所列样本之中,建议做预实验验证其检测有效性。

  ④若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3,否则会造成假阴性结果。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1658.html

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