血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用。小管形成实验是测量在体外血管生成的一种快速的、可量化的方法。一般做的多的是研究内皮细胞的小管形成。内皮细胞结合条件培养基接种于一定基底上，易形成三维网状结构。然后通过图像分析软件对小管结果进行定量分析。

　　一、血管形成实验步骤    

　　1. 细胞的准备

　　用于成管的细胞一定要代数少，状态好。像常用的HUVEC的细胞系一般多采用7代以内细胞活力最好的时候用于成管试验，若细胞状态不佳成管则较困难。

　　2. 基质胶的准备

　　目前基质胶都采用的是Corning公司的Matrigel。

　　(1）Matrigel的成分：

　　Matrigel是来源于EHS小鼠肉瘤的基底膜基质，其中含有约60%层粘连蛋白、30% IV 胶原和8%的巢蛋白，还含有基底膜聚糖、TGF-ß、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、组织纤溶酶原及其他生长因子。

　　(2）Matrigel的种类：

　　Corning公司Matrigel主要有常规标准型（Standard）、高浓度（HC）、无酚红（Phenol red-free）、生长因子减量型（Growth factor reduced, GFR）和人胚胎干细胞专用（hESC-qualified）几个类别。

　　标准型Matrigel：浓度范围大致为8-12mg/ml

　　高浓度Matrigel：浓度范围大致为18-22mg/ml

　　无酚红Matrigel：不含酚红，产品完全融化后颜色透明

　　生长因子减量型Matrigel：Matrigel里包含的生长因子经过减量处理

　　人胚胎干细胞专用Matrigel：经过对hESC培养的测试，可以用于人胚胎干细胞的培养

　　(3)Matrigel的选择：

　　我们一般选择经济适用款——标准型Matrigel，基本上就可以满足实验要求。但由于实验要求Matrigel浓度大于10mg/mL,所以购买前，要咨询厂家，选取浓度在10mg/mL以上的批次。已购买的，可以在Corning官网：https://www.corning.com/asean/en/products/life-sciences/resource-library.html进入质检证书查询页面，输入货号与批号，点击查找，获得相应COA文件。该文件中有蛋白浓度的说明。

　　3. 实验流程

　　(1)第一天matrigel放入4℃冰箱过夜。第二天待matrigel冻融后，4℃离心数分钟。冰上操作。matrigel用预冷枪头混匀，EP管提前预冷，每500ul分装。

　　(2)24孔板和1ml的头放置冰箱或冰上预冷30min。很多人选择96孔板，但其Matrigel基质胶比较难铺平，细胞不易铺匀,拍照也不方便。

　　(3)取250μl/孔Matrigel基质胶加入24孔板中，加入时避免产生气泡，置于细胞培养箱中60min待其凝固。

　　(4)取1ml含EDTA的胰酶消化细胞，待消化完全后，加入含血清培养液终止消化，计数后用培养基重悬细胞并调整细胞密度为2-3 x 105个/ml。(细胞浓度对于成管也起到至关重要的作用，初次做，建议细胞浓度做几个梯度——1 x 105 ；2 x 105；4 x 105个/ml......)

　　(5)胶凝固后，取出24孔板，每孔加入500μl细胞悬液，做好标记后放入细胞培养箱常规培养3~6h(细胞种类，接种量，对成管时间有一定的影响，基本上3h就开始有小管形成，随着时间的推移，成管量增加，但达到一定时间后，形成的小管会逐渐瓦解，所以要选取合适的时间点拍照。如下图:

　　(6)分析：100、200倍显微镜下随机5个视野观察计数血管内皮细胞小管分枝、小管数、小管长度等。可以根据需要进行calcein荧光染色,如下图：