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荧光定量PCR原理,通过标准曲线对未知模板进行定量分析的两种方法

2022-07-13 10:23:31
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  荧光定量PCR原理

  荧光定量PCR技术,是指在普通PCR技术的基础上,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。主要有两种方法:

  1、染料法:SYBR Green 染料

  在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

快速认识荧光定量PCR原理

  2、TaqMan探针法:

  探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

快速认识荧光定量PCR原理

  Ct值

  1、Ct值含义

  Ct值(Cycle threshold,循环阈值)的含义为:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

  2、Ct值与初始模板的关系

  固定循环数后,荧光型号与模板数成正比;

  初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少;

  初始模板的对数浓度与Ct值呈线性关系,根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。

  优势与应用

  可完成快速多重检测;

  操作时间短,大通量;

  定量:确定发病标准;

  数据化,可对比分析;

  鉴别诊断,区分野毒;

  疫苗质量含量的评价;

  动保产品的临床评估。

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