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细胞内蛋白质印迹法实验步骤(细胞内蛋白质印迹法)

发布时间:2022-05-26 10:31:43 阅读:1602次 来源:百度学术

  A. 溶液与试剂

  :用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

  10 X 磷酸盐缓冲液 (PBS):为了配制 1 L,添加 80 g 氯化钠 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4g 磷酸氢二钠 (Na2HPO4) 和 2.4g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。调节 pH 至 7.4。

  甲醛, 16%, 无甲醇,Polysciences 公司出品。(货号#18814 ),使用新鲜制剂,小瓶打开后避光 4°C 保存,在 PBS 中稀释后使用。

  封闭缓冲液:准备 25 ml 缓冲液,将 2.5 ml 10X PBS,以及1.25 ml 与二抗同一物种来源的正常血清(例如 正常山羊血清 (#5425) ,正常驴血清)加入到 21.25 ml dH2O 中并混匀。搅拌时加入 75 µl Triton X-100 (100%)。

  抗体稀释缓冲液: 要制备 40 ml 溶液,将 4 ml 10X PBS 加入到 36 ml dH2O 中并混匀。加入 0.4 g BSA 并混匀。搅拌时加入 120 µl Triton X-100 (100%)。

  荧光素标记二抗。

  :首次使用一抗或荧光素标记二抗时,将抗体滴定至最佳稀释比例,使样品在最少的背景干扰下,获得最强的特异性信号。

  B. 固定和免疫标记

  :对于每个抗体,请参考免疫荧光法实验步骤,以确定推荐的抗体特异性固定和通透化条件。

  :细胞应当在多孔板上直接培养、处理、固定和染色。

  :为避免单个孔中细胞分布不均导致的边界效应,将新接种的细胞板在室温下放置一小时,再放入 37°C 的孵箱中(更多信息请参考文献 Lundholt BK, Scudder KM, Pagliaro L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 2003 8, 566–70)。

  :为了将来自散射光和背景荧光的错误信号减到最小,请使用黑壁多孔板(例如 BD Falcon, 货号 353948)。

  :避免移液器或吸引器接触到孔板内部,因为这样会留下人为假象,影响后续定量。相反,清空孔板时在废物缸上方将其倒置并剧烈摇晃,再用纸巾吸干。

  :下面列出的体积适用于标准的 96 孔板。根据细胞板上或大或小的孔调整液体体积。

  按需要在多孔板中培养和处理细胞。

  按照抗体专用免疫荧光法实验步骤中的推荐,用 50 µl 4% 甲醛或 100% 甲醇固定细胞。

  室温下固定细胞 15 分钟。

  在废物缸上方将孔板倒置并剧烈摇晃,再用纸巾吸干。

  使用室温 PBS(100 µl/每孔)将细胞板清洗三次,每次 5 分钟。

  室温下用封闭缓冲液(50 µl/每孔)将细胞封闭一小时。

  封闭样品时,可按照数据表中推荐的适用于免疫荧光 (IF-IC) 的比例,用抗体稀释缓冲液配制一抗。

  倒出封闭液并加入已稀释的一抗(总体积 50 µl/每孔)。

  :要进行双标,将小鼠来源和兔来源的一抗混合,并按其合适的稀释比例在抗体稀释缓冲液中稀释。

  盖上细胞板并在 4°C 下过夜孵育。

  用 PBS 清洗细胞板三次,每次 5 分钟。

  将荧光标记二抗*在抗体稀释缓冲液中稀释(总体积 50 µl/每孔),然后在室温条件下避光孵育一小时。

  :要进行双标,将荧光标记的鼠抗和兔抗二抗混合,并在抗体稀释缓冲液中稀释。

  用 PBS 清洗细胞板三次,每次 5 分钟。

  在缺乏基于抗体的解析时为标准化细胞数量,用 DRAQ5® 按 1:1000 在 PBS 中稀释后标记胞核(总体积 50 µl/每孔)。扫描之前,在室温条件下至少避光孵育 30 分钟。

  :DRAQ5® 不能与 DyLight® 680 偶联二抗配合使用。DRAQ5® 的发射光谱和 DyLight® 680 重叠,无法区分每种染料产生的信号。

  :为达到更佳的光学分辨率,可清空 DRAQ5® ,并用 PBS 清洗孔板至少一次。

  根据制造商的说明书扫描孔板。(确保在扫描之前细胞板底部已擦干净)。

  *推荐的二抗:

  兔抗

  Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5366

  Anti-Rabbit IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5151

  鼠抗

  Anti-Mouse  IgG (H+L) (DyLight® 680 Conjugate) #5470

  Anti-Mouse  IgG (H+L) (DyLight® 800 Conjugate) #5257

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1192.html

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