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edu细胞增殖实验,BrdU 细胞增殖实验步骤

2022-05-26 10:29:32
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  A. 试剂制备

  用纯净水稀释 20X Wash Buffer(每个 BrdU ELISA 试剂盒均包括)来配制 1X Wash Buffer。

  用 Detection Antibody Diluent(绿色)按 1:100 的比例稀释 BrdU Detection Antibody,以配制 1X 检测抗体溶液。

  用 HRP-linked Antibody Diluent(红色)按 1:100 的比例稀释 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody,以配制 1X HRP 标记二抗溶液。

  用细胞培养基按 1:100 的比例稀释 BrdU,以配制 10X BrdU 溶液。

  B. BrdU 掺入

  将细胞放入 96 孔板上,并与相应的检测物质进行孵育。一般的种子细胞数目为 2500–100000 个细胞/孔,具体取决于细胞生长率。一般的孵育时间为 1-72 小时。

  添加配制的 10X BrdU 溶液到平板孔中,以获得 1X 的最终浓度。示例: 如需往培养板添加 100 µl 培养基,则每孔添加 10 µl 10X BrdU 溶液。

  将细胞放入恒温器。一般的孵育时间为 1-24 小时。

  去除培养基。如需悬浮细胞,则以 300 g 的离心力离心分离平板 10 分钟,随后去除培养基。

  C. BrdU 检测

  按 100 µl/孔添加 Fixing/Denaturing Solution,并将平板放在室温下 30 分钟。去除溶液。

  按 100 µl/孔添加配制的 1X 检测抗体溶液,并将平板放在室温下 1 小时。去除溶液,平板用 1X Wash Buffer 洗涤 3 次。

  按 100 µl/孔添加配制的 1X HRP 标记二抗溶液,并将平板放在室温下 30 分钟。去除溶液,平板用 1X Wash Buffer 洗涤 3 次。

  添加 100 µl TMB Substrate。

  室温孵育 30 分钟。

  :观察颜色变化,因为可能需要在 30 分钟的标准显色时间之前停止反应。

  添加 100 µl STOP Solution。

  读取在 450 nm 处的吸光度(要获得最佳读数,则在添加 STOP Solution 30 分钟内读取平板)。

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