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细胞培养的方法及影响因素盘点

发布时间:2023-04-29 10:27:04 阅读:14222次 来源:百度学术

  细胞的生长,主要是指细胞体积的增大,细胞分化完成后并不是所有的细胞都有生长的过程,大多数的组织器官都是通过不断的细胞分裂以增加细胞数量的方式来实现器官生长,只有很少数细胞(像神经元细胞)是通过增大细胞体积的方式来实现器官生长的,随着个体的不断发育,神经元细胞,特别是轴突的部分也要不断的伸长。

  培养过程

  培养细胞生长过程:潜伏期→指数增生期→停滞期

  一、潜伏期(latent phase):

  细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束.细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期,约24-96小时或更长,连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短,仅需6-24小时。

  二、指数增生期(logarithmic growth phase)

  这是细胞增殖旺盛的阶段,分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数(Mitotic index,MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,原

  代细胞分裂指数较低,而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%。

  指数增生期的细胞是细胞活力,好时期,是进行各种实验,佳时期,也是冻存细胞的,好时机。在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3-5天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,,后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象(contact inhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled up)。细胞接触汇合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多。但是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Density Inhibition)。

  三、停滞期(Stagnate phase)

  细胞数量达到饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期。此时细胞数持平,故也称平台期(Plateau phase)。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动。如不进行分离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代。

  影响因素

  细胞生长受温度、渗透压等外界因素的影响。

  温度

  一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强,在低温下,细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时,虽影响细胞代谢,但并无伤害作用;把细胞置于25~35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减缓;放在40℃数小时后,再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长,对细胞生长不利,甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低,在降到冰点以下时,细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂,封入安瓿中后,置于液氮中,可起保护作用,此时细胞可耐受-70℃以下温度,能长,期储存,解冻后细胞复苏,仍能继续生长增殖,细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。

  细胞在39~40℃培养1小时,能受到一定损伤,但仍有可能恢复,但不能忍受温度再升高2℃,持续数小时,即在41~42℃中培养1小时,细胞损伤严重,温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏,核分裂的破坏,产生凝固酶使细胞发生凝固,另外使蛋白质变性。因此,体外培养细胞时一定要避免高温。

  渗透压

  细胞在高渗溶液或低渗溶液中,可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以,渗透压是体外培养细胞的重要条件。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关,但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此,按一定比例控制培养液中离子平衡,维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力,而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等),直接影响细胞基本合成系统。

  理想的渗透压因细胞的类型及种族而异,人血浆渗透压为290mmol/L,被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290~300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250~325mmol/L,鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中,260~320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。

  气体环境和pH

  体外培养细胞需要理想的气体环境,氧和二氧化碳是细胞生存必须的条件。氧参加细胞的三羧酸循环,产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。有些细胞在低氧条件下,可借糖酵解取得能量,但多数细胞低氧时不能生存。氧张力通常维持在略低于大气状态,若氧分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。采用开放式培养时(碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养),一般要把细胞置于95%空气加5%二氧化碳的混合气体环境中。

  CO2既是细胞的代谢产物,又是细胞生长所必需的成分,并与维持培养液的pH有关。在密闭瓶中CO2浓度偏低的情况下,细胞容易生长;一般不能低于1%,否则有损细胞。CO2增加将使pH下降。大多数细胞适于在pH7.2~pH 7.4条件下生长,低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害,甚至退变或死亡。各种细胞对pH的要求不尽相同。一般原代培养细胞对pH的变动耐受性差,永生性细胞系和恶性细胞对pH的变动耐力强。但总的来说,细胞对碱性不如对酸性的变化耐受,偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强,不断释放CO2,使培养基变酸,pH发生变化。所以,为了维持培养环境恒定的pH,多采用在培养液中加入磷酸盐等缓冲剂的方法。磷酸缓冲剂中的NaHCO3可供给CO2,但CO2易于逸出,故只适用于封闭式培养。若开放式培养还是置于含有5%CO2的气体环境中为宜。为克服NaHCO3调整的麻烦,也可用羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-ethanesulfonic acid,Hepes),它对细胞无毒性,也不起缓冲作用,主要作用是防止pH迅速变动,在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH。

  无毒和无菌

  无毒和无菌是体外培养细胞的要环境条件。细胞在活体内,偶尔有细菌或有害物质入侵,因体内有强大的解毒系统和免疫系统,可将其解毒或清除,而不易受损害。但在离体的环境中,失去了防御系统,一旦有害物质入侵或细菌污染,可导致细胞死亡,功尽弃。如培养瓶皿、支持物、培养基、瓶盖、瓶塞上若有细胞毒性,在培养过程中可导致细胞死亡。因此,在选用这些器皿、材料时要注意,若这些物品消毒不彻,底,带菌或操作过程不小心使细胞污染,也会导致细胞死亡。若出现交叉污染,可使实验室原来的细胞系失去原有特性,应引起足够的重视(后面有详述)。

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