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流式细胞仪细胞周期测定步骤

2023-04-07 10:43:50
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  实验方法原理:流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中,在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测,得到该细胞的光散射和荧光指标,分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

  细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化,如G0/G1期的DNA含量为2C,而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比。

  实验步骤:

  一、取对数生长期细胞,倒去培养液,胰酶适度消化细胞,用培养液吹打,800 rpm,离心15 min去上清。

  二、PBS洗2次,加0.5 mLPBS吹匀,务必吹散。

  三、用5 mL注射器将细胞吸起,用力打入5 mL 70%(预冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定过夜(可长至2周)。

  四、800 rpm 15 min收集固定细胞,PBS洗2次。

  五、用0.4 mLPBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打(防止细胞破碎)。

  六、加RNase-A约3 μL至终浓度约为50μg/mL ,37℃水浴消化30 min;

  七、加PI约50 μL至终浓度约为65μg/mL ,在冰浴中避光染色30 min。

  八、用300目(孔径40~50微米)尼龙网过滤,上机检测。

  九、样品分析测定及打印。


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