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单细胞基因组学之前样品制备的重要性

发布时间:2022-05-22 10:41:38 阅读:1622次 来源:本站

  你的父母是否经常警告你关于 5P 的成长?“适当的准备可以防止表现不佳。”

  事实证明,当谈到微生物学时,他们再正确不过了。

  单细胞基因组学需要高度特异性的样本来处理。在大多数情况下,您从一个充满未知细胞群的异质样本开始,然后您的工作就是分类、分离、测序,然后进行研究——通常是按照这个顺序。准备样品从何而来?有哪些技术可以帮助这一过程中的关键步骤?

  让我们来了解一下。

  继续阅读以了解更多有关细胞分选器如何发挥作用的信息。

  样品制备的目标是什么?

  无论您是对细胞中的 mRNA 进行单细胞测序 、准备细菌群以进行抗菌测试,还是开发药物,您都可以通过样品细胞制备来实现一些特征。

  您需要健康、有活力的细胞。这是最重要的——如果您的技术对您的细胞壁造成过度损伤,它们可能会进一步裂解并破坏您的样品。同样,如果您使用的任何机器具有较高的内部压力,则可能会发生细胞凋亡,从而为您留下以下细胞样本:

  由于过度损坏而不太可能正常工作

  将提供错误和不准确的测序数据

  单个细胞。如果不只使用一个细胞,什么是单细胞基因组学?这需要没有团块或粘性细胞的单细胞悬液,以便您可以使用其他技术分配或捕获单细胞。研究单个细胞内的单个分子需要单细胞多组学。

  您需要一个无碎屑和无污染的样品。在细胞生物学领域工作时,您在微米和纳米级别之间工作(在细胞器、蛋白质、DNA 和RNA的情况下) 。因此,“碎片”或“污染物”可能就像试图清理沙箱时有游轮停泊在其中。碎片可能导致机器堵塞、误报,并可能浪费数周等待克隆种群扩大的时间。仅清洁样本!

  对于大多数研究,您还需要高基线人群。细胞系如此具有革命性的原因之一是,在正确的培养基和条件下,您可以让细胞无限增殖。例如,世界各地每个实验室的每个 CHO 细胞都来自同一只雌性仓鼠。对于实验室中的实验,您需要大量人群来测量结果、确认准确性,并在某些情况下证明同质性和适当的克隆扩增。

  目标直接在您面前,您现在可以适当地瞄准。让我们谈谈准备样品的细节。

  准备样品 | 技巧和窍门

  单细胞制备技巧和窍门都可以总结为蛋奶酥(或儿童)所需的相同建议:小心对待。否则它可能会爆炸或放气……蛋奶酥……不是孩子们。

  虽然有一些去除死细胞的方法(详见下文),但您不想依赖“先行动,后去除”。因为在有死细胞的地方,也有即将死去的细胞(裂解;细胞凋亡)、不健康的不能再生的细胞,以及全能的不活细胞。虽然很容易区分死细胞和快乐、健康的细胞。当你在死亡的范围内旅行时,它变得更加困难。

  为了避免所有的光谱、楼梯和不祥的黑暗走廊……死亡,让我们通过在以下情况下谨慎行事来保持细胞的健康和活力:

  清洗样本——您通常会被要求用磷酸盐缓冲盐溶液 (PBS) 清洗您的细胞样本。这需要彻底(但温和)洗涤方案,将细胞悬浮并放入离心机中。这使您可以更轻松地移取 PBS,留下细胞沉淀。

  移液– 移液是其中一种技术,通过大量练习,您可以真正 精通。然而,因为你在荧光太阳下的所有事情上都使用了这种技术,所以通过大量的练习,也很容易变得非常懒惰。在这里将重申样品制备中移液的两个基本原理(因为您的教授可能在您的学生时代回应了这一点):

  即使使用大口径移液器,移液器的力量也会损害细胞活力并对样品质量产生负面影响。始终以温和和一致的压力为目标。

  因为细胞溶液可以快速沉淀(在顶部或底部),所以立即移液很重要,并且每次都从孔的中间移液。这将防止不一致的样本。

  细胞分选和分选后分析——您可能会使用流式细胞仪等机器对细胞进行分选,但由于分选压力很大,细胞分选过程虽然是必要的,但可能会导致大量细胞死亡。因此,您需要进行分拣后分析,以确定分拣后样品的生存能力。

  注意:虽然传统的细胞分选器会导致大量细胞死亡(内部压力超过 20 psi),但有新技术使用小于 2 psi 的内部压力来显着改善这一过程步骤。请参阅下一节:帮助制备样品的技术 。

  去除任何死亡或无法存活的细胞——因为死亡、无法存活的细胞更容易裂解并在您的样品中形成团块,因此去除它们至关重要,以免它们影响群体中的其他健康细胞。因此,通过去除死细胞,您可以更好地为下游分析准备样品。

  样品制备后储存——当您完成洗涤、过滤、移液操作并去除死细胞以创建完全分离的样品后,可以在运行分析之前将细胞悬液置于冰上一小段时间。尽管对于确切的临时存储需求,请务必确定不同细胞类型的适当条件。

  虽然记住这些基本技术非常重要,并且可以帮助您以简单而有意义的方式改善您的实验室结果,但也有一些技术可以在此过程中提供帮助。

  帮助制备样品的技术

  从流式细胞仪到单细胞克隆,有一些技术正在迅速发展以帮助单细胞基因组学。一些比较流行的包括:

  流式细胞仪-荧光激活细胞分选 (FACS) – 该技术通常与流式细胞仪结合使用。例如,如果您有需要分选的异质样本,您可以使用荧光抗体标记目标细胞类型,然后可以从异质群体中分拣出这些细胞。然而,由于高压和减压冲击,这通常会对细胞产生剪切应力。

  这就是 NanoCellect 的WOLF 细胞分选器的用武之地。了解研究人员的这个痛点,Wolf 细胞分选器利用低内部压力(低于 2 psi)来创建一个不会损害细胞活力的高效流式细胞仪。此外,它使用一次性墨盒来避免交叉污染,并为初学者和专家提供直观的软件。

  什么是没有样品准备的单细胞基因组学

  没有样品准备的单细胞基因组学就像没有钻石的棒球;没有电梯的天际线公寓大楼;没有奶酪的熟食店!

  所有这些,包括单细胞基因组学,在没有它们的合作特征的情况下,在技术上都是可行的。尽管对于公寓大楼、熟食店、棒球,甚至是单细胞基因组学,您的父母可能会反对“适当的准备”和“防止表现不佳”。

  为了让您的父母和 您使用的单个细胞感到高兴,请确保将 5 P 应用于您的细胞分类过程。

  在 NanoCellect,我们知道快乐的细胞……快乐的父母是另一回事。

  资料来源:

  罗杰癌症中心。样品制备。https://www.rogelcancercenter.org/single-cell-analysis-core/sample-preparation-and-costs

  咬大小生物。防止移液错误破坏实验的 17 种方法。https://bitesizebio.com/344/17-ways-to-stop-pipetting-errors-ruining-your-experiments/

  NCBI 。通过荧光激活细胞分选 (FACS) 纯化特定细胞群。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3144656/

  NCBI 。流体动力聚焦——一种多功能工具。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3251643/


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1177.html

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