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RNA测序分析:您需要知道的一切

发布时间:2022-05-22 10:36:47 阅读:1972次 来源:本站

  存在三种不同类型的 RNA 分子:信使 RNA (mRNA)、转移 RNA (tRNA) 和核糖体 RNA (rRNA)。结合起来,它们的作用是将 DNA 链的副本从细胞核带到核糖体以产生蛋白质。这种运动部件的复杂混合物在细胞的凝胶状液体中共同作用,产生了我们所知道的生命……

  难怪它值得排序和分析。

  DNA vs RNA vs 蛋白质 | 快速入门

  为了让每个人都在同一页面上,这里有一个快速入门,每个人都可以享受解码的乐趣。这三种化合物——DNA、RNA 和蛋白质——具有类似链式反应的关系。

  DNA是整个基因组的蓝图。整个有机体的任何和所有遗传信息都与 DNA 一起存储。对于人类来说,这包括从我们的指甲长得有多快到我们的胡须是什么颜色的头发。所有这一切都取决于每个细胞中包含的基因。

  RNA(简单地说)是一小段DNA。它是另一个核酸序列链,它从 DNA 中获取信息并使用它来制造蛋白质。DNA 到 RNA 的这一过程称为转录,它允许来自 DNA(卡在细胞核中)的信息离开细胞核并最终从信息到物质。存在三种不同类型的 RNA:信使、核糖体和转移。

  这些蛋白质是由核糖体和三种不同类型的 RNA 在核糖体工厂中产生的。发生这种情况的过程称为翻译,然后蛋白质执行其功能(无论可能是什么)。

  RNA 代表了这个深刻的信息库 (DNA) 和该信息的果实 (蛋白质) 之间的联系。

  对这些核肽链进行测序,结合当前的 DNA 文献,使研究人员能够就理论与实现之间的这座桥梁收集各种见解。

  有了这个,让我们转向 RNA 测序以及流式细胞仪如何在这个过程中发挥作用。

  RNA测序终极指南

  RNA 测序 ( RNA-seq ) 是一种旨在分析 RNA 内基因表达转录组的技术。这涉及到 RNA 序列的类型和数量,通过使用下一代测序来产生 RNA-seq 数据。

  RNA seq 数据分析的步骤包括:

  实验设置:确定您正在测量的内容

  准备 RNA 样本

  创建测序文库

  RNA测序

  分析RNA测序结果

  第 1 步:设置

  由于完成一个RNA seq实验需要大量的时间和精力(以及研究经费),因此正确完成设置非常重要。首先,确定 RNA 测序实验是否旨在提供定性或定量反馈:

  定性结果——也称为注释信息,这为 RNA 测序分析提供了一种更具探索性的方法。它更有可能用于识别异常、罕见的 RNA 转录实例和异构体。它通过读取基因和基因结构来做到这一点,而不是专注于基因表达水平。

  定量结果- 也称为差异基因表达,定量结果为您提供明确的测量值,可用于推断基因计数和相关的方差。这包括主要的三个:

  生物学方差:对照组或治疗组之间的方差

  抽样方差:样本中只有一小部分基因被测序

  技术差异:由图书馆创建引起的差异

  通过事先正确定义变量(目标转录本、效应大小、测量属性),您应该能够从一开始就确定RNA-seq数据的“相关性”。这也将允许您准备重复实验,以便获得具有统计意义的大量信息来发布有意义的结果。

  第 2 步:准备 RNA 样本

  设置完成后,就可以准备要测序的 RNA 样本了。这不仅仅是抓住最近的测定和移液器。这里的想法是获得一个健康、可行的 RNA链样本,该样本被分离和纯化。

  使用(通常)两种RNA提取方法中的一种,一次一步发生这种情况:

  固相萃取——RNA 与二氧化硅纤维结合,然后在混合回溶液之前清洗掉污染物。

  有机萃取——利用裂解特性从细胞中分离 RNA,然后过滤掉污染物。

  第 3 步:创建测序库

  为了使数据和最终的 RNA-seq数据分析有意义,必须对结果进行衡量。这就是测序文库。

  现在您有了分离和纯化的 RNA分子样本,这些 RNA 链(一旦被激活)将开始产生肽链并将氢释放到溶液中。半导体将能够测量这种反应并将信息转换为数据(0 和 1)。然后,测序文库充当每个可能反应的条形码扫描仪。

  大多数下一代测序技术将为您构建这些文库——利用聚合酶链式反应 (PCR) 的概念来扩增 样本中可用的 RNA 拷贝。

  第 4 部分:RNA 测序

  下一代测序技术正在迅速开发新的高效批量 RNA测序方法。大多数可用技术能够提供分析所需的 RNA 测序和数据。您选择哪一个取决于许多因素 - 但是,一旦决定,请确保您有以下可用信息:

  无论您需要单端还是双端测序

  每个 RNA 读取的长度

  引发位点的引物结合 RNA 序列

  第 5 部分:分析 RNA 测序结果

  对基因组信息进行测序和提取可用数据确实处于现代科学的前沿,尤其是在单细胞基因组学方面。DNA 中包含的惊人数量的数据 - 在单个细胞内 - 与精神现象接近(了解有关单细胞多组学技术的更多信息)。这在单细胞 RNA seq 中得到了揭示。

  需要生物学家、数学家、计算机科学家和统计学家来解释数据。它是“大数据”与“微生物学”的结合,操纵数据以策划可用的结果需要大量的计算能力和创造性的想象力。

  为此,已经开发了一些关键的RNA seq 分析工具。

  从新大会

  将结果与单细胞 RNA 测序文库参考对齐

  在使用任一工具之前,必须使用以下步骤处理数据:

  解复用样本结果。通常,样本是多个测试的异质混合物(为每种混合物编码)。这些都需要解码。

  然后从数据中删除用于编码每种混合物的适配器序列。

  如果在某些读取中怀疑测序错误,则必须将其过滤掉或“修剪”。

  使用统计分析工具规范化数据可以让您更好地读取数百万个数据点。

  完成后,下面的分析工具有助于在没有已知库参考(从头)和有一个(与参考对齐)时量化结果。

  再次组装

  当基因组序列是新的并且没有为其构建参考时,从头组装可以帮助您构建参考转录组(因此,“从头”翻译为“从头开始”)。这个过程虽然有用,但非常棘手,因为研究人员必须手动处理变体、多态性和任何测序错误。确定什么是错误以及什么是排序的一部分使得这是一个痛苦的过程。这就是为什么,对于从头组装,您需要更长的读取时间。

  将结果与库参考对齐

  当 RNA 测序产生可以映射到参考库的短读数时,计算程序可以非常有效地做到这一点。在这个参考系统中,同样的错误继续出现——变体、多态性和测序错误——但是,使用统计近似,可以过滤掉其中的大部分。此外,通过操纵实验中的参数和使用不同的统计模型,您可以慢慢开始更好地分析单细胞测序数据。

  对细胞进行分类 | RNA测序的初步“步骤0”

  在上述步骤之前,您的工作流程中可能涉及第 0 步——对样本中的细胞进行分类。

  同质群体的实验使分析变得更加容易,因为它从测试中删除了额外的变量。使用流式细胞仪通常归因于内部压力导致的细胞裂解和细胞凋亡。这适用于使用 20 psi 或更高内部压力的行业标准流式细胞仪。

  然而,NanoCellect 一直在改变行业标准。他们的WOLF 细胞分选仪在小于 2 psi 的内部压力下运行,使其比下一个温和的流式细胞仪轻十倍。此外,它不会牺牲效率,而且还具有其他有用的品质,例如:

  一次性墨盒:无需担心样品之间的交叉污染,只需换一个新的。

  小巧便携:不到 2 立方英尺,可以放在任何实验室的工作台上。

  直观的软件:它具有研究人员想要的所有高级功能,以及初学者需要的便利。

  为了在处理RNA seq 分析时让您的细胞满意,请考虑使用 NanoCellect。在这里,细胞被分类、计数并保持活力。

  资料来源:

  NCBI 。RNA 测序:平台选择、实验设计和数据解释。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3426205/

  俄勒冈大学。RNA-seqlopedia。https://rnaseq.uoregon.edu/#exp-design

  技术网络。DNA 与 RNA – 5 个主要差异和比较。https://www.technologynetworks.com/genomics/lists/what-are-the-key-differences-between-dna-and-rna-296719

  技术网络。RNA-seq:基础、应用和协议。https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/rna-seq-basics-applications-and-protocol-299461

  NCBI 。RNA测序和分析。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4863231/


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