低至45元!病理染色【夏日盛惠】活动正在进行中
资讯动态

家兔膝骨性关节炎的动物模型的建立实验研究

2023-04-19 10:33:08
|
访问量:16192

  材料与方法

  试剂:①化学试剂:碳酸氢钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、考马斯亮兰。②细胞培养试剂与培养板:F12培养液、胎牛血清、胰蛋白酶(宝泰克)、胶原酶Ⅰ、Ⅱ型、L-谷氨酰胺、二巯基乙醇、青霉素、链霉素、6孔、24孔、96孔培养板。

  仪器:凝胶成像仪、数码照相系统、二氧化碳培养箱、酶标仪、PCR扩增仪、超声波清洗器、倒置显微镜、恒温震荡培养箱、CLP-800电泳仪、超高速冷冻离心机、梅特勒-托利多AB204-N单量程万分之一电子天平、超小型电泳仪Mupid-2。

  实验材料:新西兰大白兔。

  动物模型及分组:雄性新西兰白兔8只,3~5个月龄,体重2.5~3.5kg,平均2.85kg。随机分两组,每组4只。

  手术方法:①实验组:用20%乌拉坦(5ml/kg)静脉麻醉,取髌内侧切口长约2cm,逐层切开软组织,打开关节腔,将髌骨外翻,将双膝关节内侧副韧带、前后交叉韧带切断并切除内侧半月板,注意勿损伤关节软骨;冲洗关节腔后,逐层缝合切口,术后应用肌注青霉素40万U/日,持续7天,术后不固定伤肢,每天驱赶兔奔跑2次,每次强迫其活动1小时,模型建立需8周。②对照组:实验动物采用同样的麻醉方法,只打开关节腔后,同样将髌骨脱位,保持关节腔暴露时间大致同实验组,其余处理同上。

  取材鉴定:手术后 8 周空气栓塞处死动物,无菌条件下取双侧膝关节标本。实验组软骨面色泽灰暗,表面粗糙糜烂,软骨下骨外露,骨赘增生明显,尤以胫骨内侧髁明显。对照组软骨表面光滑,色泽正常,未见软骨表面裂纹及凹陷,无骨赘形成。

  主要实验试剂及药物制备:①D-Hank's平衡盐溶液:电子天平分别称量NaCl 8.00g/L、KCl 0.40g/L、NaHPO4・H2O 0.06g/L、KH2PO4 0.06g/L、NaHCO3 0.35g/L、酚红0.02g/L,加入去离子水溶解,搅拌均匀,加入青霉素20万U/ml 500μl、链霉素20万U/ml 500μl,定容至1000ml,浓盐酸调节pH值至7.0,过滤**备用。②F12细胞培养液:电子天平分别称量NaHCO3 2g、MgSO4 74.64mg/L、葡萄糖2g,加入F12干粉中,用去离子水溶解,加入青霉素20万U/ml 500μl、链霉素20万U/ml 500μl,搅拌均匀,定容至1000ml,浓盐酸调节pH值至7.6,过滤**并以500ml/瓶分装,按比例加入胎牛血清、2-ME及L-谷氨酰胺,4℃备用。

  软骨细胞提取与培养:将手术收集的软骨标本放入10ml无菌玻璃平皿,倒入D-Hank's液掩盖标本;在另一平皿中,加入少量F12培养液,用手术刀切碎软骨,使成1~2mm3的小块;移入离心筒中,用F12培养液掩盖,离心1000rpm 5分钟;收集全部切碎软骨,除去F12,加入8ml 1×透明质酸酶,室温下作用5分钟;除去透明质酸酶,另加入16ml透明质酸酶,室温下作用10分钟;祛除透明质酸酶,用F12清洗两遍,每次10ml,离心1000rpm 5分钟。用1×胶原酶4ml清洗5分钟,祛除清洗液;加入8ml胶原酶,37℃培养30分钟,离心600rpm 5分钟;保留上清至无菌离心筒中;加入20ml胶原酶,37℃培养90分钟继续消化;视组织消化程度,一般消化至组织蓬松,呈絮状;收集上清液,1000rpm离心8分钟,获得细胞团;弃上清,将细胞悬浮于16mlF12培养液中,200目过滤至新无菌离心筒中。10μl移液器取细胞悬液1μl,计数。按5×104接种于培养瓶中。37℃、5%CO2孵箱中培养。2~4日,F12培养液换液1次。

  软骨细胞生长曲线的测定:取生长状态良好的细胞,制成细胞悬液。经计数后,将细胞以1×10^4/ml接种于24孔板中;每隔1天取3个孔细胞进行计数,计算均值,培养2~4天给未计数的细胞换液;以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,将计数点连接成曲线。

  结果与分析

  骨性关节炎软骨组织病理:显微镜下观察,实验组软骨表面出现溃疡,各层结构界限消失,潮线紊乱乃至多重,软骨细胞减少,但大量簇集。对照组软骨表面光滑,层次清楚,软骨细胞排列整齐,分布均匀,潮线清晰完整,软骨细胞数量正常,无簇集。

  软骨细胞:骨性关节炎软骨细胞与正常软骨细胞形态相似,为贴壁细胞,呈多角形,偶可见梭形,原代细胞培养时软骨细胞呈岛状生长;传代软骨细胞贴壁良好,细胞饱满、透明,细胞多层生长时,可见细胞分泌胞外基质。

  正常、骨关节炎软骨细胞生长曲线:传代正常、骨性关节炎软骨细胞近似“S”形,生长周期约在3周,经过1周的潜伏期,软骨细胞进入对数生长期,2周左右达到平台期后稳定生长,本实验选用作图法,即在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需时间。据观察,骨性关节炎软骨细胞生长周期较正常软骨细胞生长周期短,且于传代培养1~1.5周两种软骨细胞均处于对数生长期,适于进一步进行实验研究。


  • 业务咨询

    业务咨询专线:133 7682 0615

    Email:lxyjy@wie-biotech.com

在线留言(即刻联系为您提供专业的解决方案) ×
留言咨询

病理染色【夏日盛惠】活动正在进行中,点击查看活动详情。

欢迎前来咨询~