细胞培养是每个实验人员的必备技能，俗话说：细胞养得好，实验没烦恼，然而事实却是，实验室的小细胞们经常容易“生病”，别人的培养基粉红透亮，细胞长势喜人，而自己在细胞培养中却经常出现各种不明原因的浑浊和沉淀，这是什么情况呢?

　　细胞培养时出现沉淀主要有2大原因：

　　一，细胞本身被污染;

　　二，培养基中有金属、蛋白和其他培养基组分的沉淀;

　　首先，我们先来看看细胞污染。

　　1，细菌/真菌/酵母污染

　　细菌、真菌和酵母污染相对来说“道行尚浅”，是因为它们容易被肉眼和显微镜识别，如下图：

　　在这三种污染重，细菌污染是三者之中个性较强的一位，有一定的辨别难度，常见的细菌有：杆状菌、球状菌和螺旋状菌。

　　2，支原体污染

　　支原体可是细胞的天敌，这是因为支原体的平均直径只有 0.1~0.3 µm ，这在显微镜下都无法识别。

　　并且，由于支原体污染初期生长缓慢，更是没有肉眼可以观察到的现象。

　　检测：常用的检查方法为培养检测法，即取1mL细胞培养液加入支原体液体培养基中，培养5天后，观察培养基的颜色变化。如果变黄则怀疑该细胞受到支原体污染。如果不变色，则盲传一代。

　　若颜色变黄，可接支原体固体培养基，于5%CO2培养箱中培养3～5天，观察有无“煎蛋”状支原体菌落。一旦发生污染即淘汰该细胞和培养液。

　　图：支原体污染 (左侧：电镜照片(×30k); 右侧：电镜照片(×12k))

　　此外，支原体污染还可用荧光染色法和相差显微镜观察法等检测方法,或者直接购买支原体检测试剂盒进行检测。

　　处理措施：

　　●定期用支原体试剂盒检测;

　　●换液可以减缓污染情况，但无法根除;

　　●支原体清除试剂盒可以达到较好效果;

　　●小鼠腹腔巨噬细胞清除法。

　　3，真核细胞污染

　　真核细胞污染是指一个细胞系中混入了其它细胞。由于各种细胞的外形大小差异甚微，这种污染同样很难被识别。

　　一般碰到这种情况，只能是将细胞丢弃了，因为这将对会对实验结果可重复性产生重大的影响。

　　接下来，我们来看看培养基的问题。

　　如果排除了污染，细胞培养基中的浑浊通常被解释为金属、蛋白和其他培养基组分的沉淀，沉淀物可能损害细胞健康，因为他们通过螯合可移除养分和其他需要的组分，从而改变培养基的组成。

　　产生沉淀的可能原因及解决方案：

　　1，温度变化

　　在细胞培养中，温度是引起沉淀的主要因素之一。当遭遇温度的极端变化时，高分子量血浆蛋白会从溶液中析出;

　　解决方案：

　　大家在培养细胞时一定要注意按照说没事要求选择最佳的培养基储存和操作方法，并且要避免反复冻融。

　　2，失水诱导的浓度改变

　　如果培养基可能蒸发，培养基组分(包括盐) 的浓度将会增加，特别是培养基表面可能容易形成

　　晶体沉淀。

　　解决方案：

　　●确保培养瓶/板不经历蒸发，监测孵育箱加湿效果;

　　●密封培养器皿避免脱水。

　　3，钙盐

　　制备无血清培养基时，组分添加的顺序可能导致不可溶分子的形成。钙盐尤其容易沉淀，比如CaCl2和MgSO4在溶液中反应产生CaSO4晶体。高压灭菌和pH值不稳定会加剧这一问题。

　　解决方案：

　　●逐个添加其它培养基组分之前，用去水离子水单独溶解CaCl2

　　●可添加缓冲液避免渗透压的变化。

　　4，金属补充物

　　铜、铁和锌等金属离子是细胞生长所必需的，是无血清培养基的重要补充物。

　　培养系统中其他血清组分的缺失可能导致这些金属沉淀，为细胞形成有毒的环境。

　　在较高pH环境下(一般>8时)，碳酸盐和氢氧根离子与铜离子、磷酸盐和氢氧根离子与铁离子、碳酸盐、磷酸盐和氢氧根离子与锌离子、氢氧根离子与镁离子易形成不溶性沉淀物;

　　在氧化条件下，铜和锌更易于沉淀。

　　金属沉淀物对照颜色表

　　解决方案：

　　●铁结合蛋白转铁蛋白的加入可防止铁在培养中沉淀;

　　●可添加缓冲液避免渗透压的变化。

　　●向培养基中补充甘露醇或丙酮酸以结合过氧化氢，尽可能降低氧化应激。

　　学会对各种污染情况的辨别和处理是一项不可或缺的实验技能，希望大家在看完我们的文章后结合你的实验操作，学会如何应对细胞污染。