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BrdU参入法细胞周期测定步骤

2023-04-07 10:35:55
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  BrdU参入法

  实验方法原理:细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

  单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。

  BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占1/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。

  一、试剂配制

  二、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10 μg/ml。

  三、44小时加秋水仙素,使每ml中含0.1 μg。

  四、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

  五、常规染色体制片。

  六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。

  七、弃去2×SSC液,流水冲洗。

  八、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。

  九、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

  十、计算

  细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)

  细胞周期(cell cycle)是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,分为间期与分裂期两个阶段。

  1.间期

  间期又分为三期、即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。

  (1)G1期

  此期长短因细胞而异。体内大部分细胞在完成上一次分裂后,分化并执行各自功能,此G1期的早期阶段特称G0期。在G1期的晚期阶段,细胞开始为下一次分裂合成DNA所需的前体物质、能量和酶类等。

  (2)S期

  S期是细胞周期的关键时刻,DNA经过复制而含量增加一倍,使体细胞成为4倍体,每条染色质丝都转变为由着丝点相连接的两条染色质丝。与此同时,还合成组蛋白,进行中心粒复制。S期一般需几个小时。

  (3)G2期

  为分裂期做最后准备。中心粒已复制完毕,形成两个中心体,还合成RNA和微管蛋白等。G2期比较恒定,需用1~1.5小时。

  2.分裂期

  细胞的有丝分裂(mitosis)需经前、中、后,末期,是一个连续变化过程,由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1~2小时。

  (1)前期(prophase)染色质丝高度螺旋化,逐渐形成染色体(chromosome)。染色体短而粗,强嗜碱性。两个中心体向相反方向移动,在细胞中形成两极;而后以中心粒随体为起始点开始合成微管,形成纺锤体。随着核仁相随染色质的螺旋化,核仁逐渐消失。核被膜开始瓦解为离散的囊泡状内质网。

  (2)中期(metaphase)细胞变为球形,核仁与核被膜已完全消失。染色体均移到细胞的赤道平面,从纺锤体两极发出的微管附着于每一个染色体的着丝点上。从中期细胞可分离得到完整的染色体群,共46个,其中44个为常染色体,2个为性染色体。男性的染色体组型为46,XY,女性为46,XX。分离的染色体呈短粗棒状或发夹状,均由两个染色单体借狭窄的着丝点连接构成。

  (3)后期(anaphase)由于纺锤体微管的活动,着丝点纵裂,每一染色体的两个染色单体分开,并向相反方向移动,接近各自的中心体,染色单体遂分为两组。与此同时,细胞波拉长,并由于赤道部细胞膜下方环行微丝束的活动,该部缩窄,细胞遂呈哑铃形。

  (4)末期(telophase)染色单体逐渐解螺旋,重新出现染色质丝与核仁;内质网囊泡组合

  为核被膜;组胞赤道部缩窄加深,最后完全分裂为两个2倍体的子细胞。

  在体内根据细胞的分裂能力可把它们分为三类:

  ①增殖细胞群,如造血干细胞,表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞。这类细胞始终保持活跃的分裂能力,连续进入细胞周期循环。

  ②不再增殖细胞群,如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞,它们丧失了分裂能力,又称终末细胞(end cell)。

  ③暂不增殖细胞群,如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的,并执行特定功能的细胞,在通常情况下处于G0期,故又称G0期细胞。在某种刺激下,这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后,剩余的肝细胞迅速分裂。

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