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蛋白质亚细胞定位步骤(如何研究蛋白质亚细胞定位)

发布时间:2022-04-03 10:36:27 阅读:13402次 来源:百度学术

  生物体细胞具有非常复杂的亚细胞结构,蛋白质在组织及细胞中的正确定位对于其生物学功能及细胞功能的正常发挥至关重要。因此,了解蛋白质的亚细胞定位信息,可以为我们推断蛋白质的生物学功能提供必要的帮助,同时也有利于深刻理解亚细胞结构。

  研究细胞定位的方法有多种,常用的有荧光蛋白标记和免疫荧光法。

  01、荧光蛋白标记

  较为常用的荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。将GFP编码序列与目的蛋白编码序列融合构成融合基因后,通过基因枪法、显微注射法、电转化等细胞转染技术,转染合适的细胞。利用目的基因的基因表达调控机制,如启动子和信号序列来调控融合基因的表达,通过荧光显微镜观察GFP在组织或亚细胞中的分布即可确定目的蛋白在细胞中的定位。

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  目的基因与GFP基因的融合有两种方式∶①GFP位于目的基因后面,即目的基因-GFP;②GFP位于目的基因前面,即GFP-目的基因。构建方式的选择要视具体蛋白具体分析,不能影响目的蛋白的定位和功能。

  注意事项

  ①考虑目的蛋白空间折叠问题,目的蛋白较大会将荧光蛋白包裹起来,影响GFP发光,建议二者之间用Linker隔开。

  ②两个基因交接处可以增加一段核苷酸(3的倍数),减小二者蛋白产物的空间结构影响,利于GFP发光。

  ③前一基因 必须要带有起始密码,而不能带有终止密码; 后一基因要保证有终 止密码。

  ④融合基因构建后,必须进行测序验证,确保融合基因读框正确后再进行后续实验。

  ⑤设置对照。 由于某些细胞本身也有自发荧光,设置对照以避免干扰。

  ⑥尽可能多的获得转基因细胞,因为并不是所有构建正确的融合基因都能正常表达,如果细胞数目较少可能会检测不到荧光。

  02、免疫荧光染色

  将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内定位的方法。用针对特异蛋白抗原的荧光标记抗体作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原,由于所形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,确定荧光所在细胞或组织,从而对抗原蛋白进行定位。


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