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大肠杆菌表达步骤

2021-08-12 07:27:59
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  大肠杆菌表达步骤

  1. 获取目的基因

  PCR或RT-PCR 法获得所需目的基因片段

  2. 重组表达载体构建

  (1) 将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切,酶切产物进行琼脂糖电泳,胶回收kit回收载体片段

  (2) PCR产物双酶切后进行胶回收

  (3) T4连接酶连接载体及片段

  3. 感受态细胞的制备(CaCl2法)

  (1) 将大肠杆菌 DH5α接种至LB培养板,过夜培养

  (2) 挑取单菌落于3-5ml LB液体培养基中,37℃震荡培养过夜

  (3) 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,37℃摇床上250-300rpm震荡培养2-3h

  (4) 吸取1.5ml培养好的菌液至离心管中,冰上冷却10min

  (5) 4℃ 3000g 离心5min

  (6) 弃上清,加入100ul预冷0.1M CaCl2,轻轻吹打混匀

  (7) 细胞悬液添加(15%-20%甘油)后分装,于-80℃保存

  4.转化

  (1) 取200ul感受态细胞,解冻后立即置冰上

  (2) 加入质粒DNA溶液(不超过50ng,体积不超过10ul)轻轻摇匀,冰上放置30min、42℃ 热击90s、冰上放置3min

  (3) 管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃ 195rpm 培养30-60min

  (4) 上述菌液摇匀后取100ul涂布于含抗生素的平板上,37℃过夜培养

大肠杆菌表达步骤

  5.  阳性重组子筛选及鉴定

  (1) 含氨苄青霉素的LB平板上,加入20ul 20mg/ml X-gal和40ul 100mmol/L IPTG,涂布均匀

  (2) 将所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上,涂布均匀,将平板置于生化培养箱中正面放置30min,再倒置,37℃过夜培养

  (3) 挑选阳性重组子进行双酶切及测序鉴定

  6.  IPTG诱导

  (1)  将测序鉴定正确的对应菌液,37℃ 195rpm培养 3-4h后测定OD值(0.6-0.8)

  (2) 加入终浓度为0.5mM IPTG

  (3) 依据不同的表达载体选择合适的培养环境

  7.  电泳检测

  (1) 将摇好的菌 12000rpm/min,离心1min,弃上清,菌体于-20℃或-80℃保存

  (2) 向收集好菌体的离心管中加入100μL PBS缓冲液,并加入20μL的5×SDS蛋白电泳上样缓冲液

  (3) SDS-PAGE检测


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