大肠杆菌表达步骤

　　1. 获取目的基因

　　PCR或RT-PCR 法获得所需目的基因片段

　　2. 重组表达载体构建

　　（1） 将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳，胶回收kit回收载体片段

　　（2） PCR产物双酶切后进行胶回收

　　（3） T4连接酶连接载体及片段

　　3. 感受态细胞的制备（CaCl2法）

　　（1） 将大肠杆菌 DH5α接种至LB培养板，过夜培养

　　（2） 挑取单菌落于3-5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜

　　（3） 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，37℃摇床上250-300rpm震荡培养2-3h

　　（4） 吸取1.5ml培养好的菌液至离心管中，冰上冷却10min

　　（5） 4℃ 3000g 离心5min

　　（6） 弃上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2，轻轻吹打混匀

　　（7） 细胞悬液添加（15%-20%甘油）后分装，于-80℃保存

　　4．转化

　　（1） 取200ul感受态细胞，解冻后立即置冰上

　　（2） 加入质粒DNA溶液（不超过50ng，体积不超过10ul）轻轻摇匀，冰上放置30min、42℃ 热击90s、冰上放置3min

　　（3） 管中加入1ml LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃ 195rpm 培养30-60min

　　（4） 上述菌液摇匀后取100ul涂布于含抗生素的平板上，37℃过夜培养

　　5.  阳性重组子筛选及鉴定

　　（1） 含氨苄青霉素的LB平板上，加入20ul 20mg/ml X-gal和40ul 100mmol/L IPTG，涂布均匀

　　（2） 将所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上，涂布均匀，将平板置于生化培养箱中正面放置30min，再倒置，37℃过夜培养

　　（3） 挑选阳性重组子进行双酶切及测序鉴定

　　6.  IPTG诱导

　　（1）  将测序鉴定正确的对应菌液，37℃ 195rpm培养 3-4h后测定OD值（0.6-0.8）

　　（2） 加入终浓度为0.5mM IPTG

　　（3） 依据不同的表达载体选择合适的培养环境

　　7.  电泳检测

　　（1） 将摇好的菌 12000rpm/min，离心1min，弃上清，菌体于-20℃或-80℃保存

　　（2） 向收集好菌体的离心管中加入100μL PBS缓冲液，并加入20μL的5×SDS蛋白电泳上样缓冲液

　　（3） SDS-PAGE检测