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实验外包:荧光定量PCR检测技术怎么理解!

2021-08-17 02:47:12
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  实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是一项以 PCR 反应为基础的 DNA 定量技术,通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量,从而达到对目的基因的定性和定量分析。常用的对 PCR 产物进行荧光定量检测的方法有两种:一种是利用荧光染料与双链 DNA 结合,通过荧光强度进行定量;另一种是利用携带了荧光报告基团的特异DNA 探针对目标基因进行定量。

  一、利用荧光染料进行定量

  一种最为常用的定量方法就是在 PCR 反应体系中加入荧光染料,此类荧光染料会与所有的双链 DNA 结合,并产生荧光。游离的荧光分子不会产生荧光信号,只有与双链 DNA 结合的荧光分子才会释放荧光,随着 DNA 拷贝数的增加,测得的荧光强度也会增强。

  利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉,只需要一对普通的引物就能完成定量。然而,常用的诸如 SYBR Green 染料会与所有的双链 DNA 无差别地结合,包括引物二聚体, 因此有可能会导致对目标基因的定量不精确,灵敏度偏低。

利用荧光染料进行定量

  二、利用荧光探针进行定量

  荧光探针只能检测出与自身序列互补的 DNA 片段,因此用探针法定量可以有效地避免引物二聚体的干扰,使定量结果更加精确。此外,通过使用携带不同荧光信号的多种探针, 我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。

  荧光探针的 5’端携带有一个荧光报告基团,3’端则为淬灭基团,在正常情况下两个基团间的距离很近,淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。在 PCR 反应过程中,引物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合;在延伸阶段,Taq 酶因为具有 5’-3’核酸外切酶活性,会将探针,使得报告基团和淬灭基团相互分开,从而释放出荧光。每增加一条目的基因的拷贝,就会有一个探针被切开并释放荧光信号,因此随着 PCR 反应的进行,荧光信号会逐渐增强。

  使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高,且可以做到同时对多个基因进行定量,但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。

利用荧光探针进行定量

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