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杂交瘤细胞测序步骤(附带优势和引用讲解)

2023-05-09 10:42:13
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  在杂交瘤细胞制备过程中,经过单克隆筛选之后,杂交瘤细胞应尽快冷冻保存。但在保存过程中,杂交瘤细胞有丢失高特异性/高活性,甚至死亡的风险,为了克服杂交瘤细胞保存的劣势,我们可以对杂交瘤细胞进行测序,随着现代生物技术的发展,测序方法具有高度的灵活性,可快速、准确地实现对杂交瘤细胞抗体轻/重链可变区或全长抗体的测序。

  测序主要步骤

  1、杂交瘤细胞的培养

  取单抗杂交瘤细胞株进行复苏,再用1640培养基37 ℃下培养10天至旺盛生长期,开始收集细胞。

  2、杂交瘤细胞mRNA提取

  使用TRIzol法提取RNA:TRIzol裂解细胞,加入氯仿,震荡后离心15min,取上清并加入异丙醇,混匀后离心10min,弃上清,沉淀用75%乙醇清洗后,在空气中晾干,并用适量DEPC去离子水溶解。

  3、RNA反转录获得cDNA

  采用SMART RACE方法将RNA反转录合成cDNA:准备5’-RACE/3’-RACE的反应体系,并选择合适的扩增程序进行PCR扩增(延伸时间根据片段大小决定),合成cDNA第一条链,然后根据已知的cDNA序列合成cDNA第二条链。

  4、cDNA PCR获得抗体重链/轻链可变区基因

  加入用于PCR扩增的高保真DNA聚合酶与兼并引物等,对cDNA进行PCR扩增,获得重链/轻链可变区基因。

  5、抗体基因连接至T载体,挑选阳性克隆并测序

  6、生物信息学分析测序结果,得到抗体序列

  杂交瘤细胞测序的优势

  相较于抗体氨基酸测序,杂交瘤细胞抗体基因测序可以更为准确地区分质谱鉴定中较难区分的氨基酸(亮氨酸/异亮氨酸等),从而提供更准确、可靠的结果。

  杂交瘤细胞测序的应用

  为申请保护性专利提供有效单抗序列信息。

  永久保留单克隆抗体序列信息,防止杂交瘤细胞丢失单抗信息。

  帮助选择目标细胞株,表达纯度更高的重组单克隆抗体。

  缩短杂交瘤细胞克隆化耗时过程,加速单克隆抗体产生速度。

  构建工程化抗体亲和力成熟,进一步提高单抗的亲和力。

  有利于构建嵌合抗体或人源化抗体。

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