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PCR​(​聚合酶链式反应)

发布时间:2021-08-11 10:00:26 阅读:13142次 来源:百度学术

  PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链式反应,是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(多为60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

  一、降落PCR(Touchdown PCR)

  通过以较高的温度起始,再随着循环逐渐降低到最佳退火温度,这种PCR方法可提升反应特异性。目标扩增子的产量相应的得到富集。

  二、巢式PCR(Nested PCR)

  巢式PCR是常规PCR的一种演变,其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中,需要设计两对引物:一对(外引物)在目标扩增区域的侧翼,而另一对引物(巢式引物)对应于所扩增DNA的准确区域。第一轮PCR的产物作为第二轮PCR的模板。

  三、多重PCR(Multiplex PCR)

  多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

  四、反向PCR(Inverse PCR)

  反向PCR起初设计用于确定临近未知区域的序列。反向PCR有助于研究一个基因的启动子序列;致癌染色体重排如基因融合、异位或转移;及病毒基因的整合。之所以称为反向PCR,是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸。

  五、直接PCR(Direct PCR)

  直接从样本中扩增目的DNA,而无需提取基因组DNA,直接PCR。细胞、组织等材料在独特的缓冲液中裂解,释放出DNA。因此这种方法简化了PCR实验流程,减少了动手操作的时间,同时可避免纯化步骤中DNA的损失。

  六、热启动PCR

  热启动PCR主要借助一种酶的修饰物(如抗体、亲和配体、适体或化学修饰物)来抑制常温下DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR反应体系配制阶段引物与模板、引物与引物之间的结合能力降低,从而避免了非特异性扩增。当反应体系配制好后,在反应初始加热步骤,酶修饰物在高温下(通常高于90 ℃)被释放,使得DNA聚合酶被激活(图1)。激活时间和温度根据DNA聚合酶及热启动修饰物的不同而有所差别。对于某些聚合酶,激活和预变性合并成了一步。

  七、快速PCR (Fast PCR)

  在快速PCR中,通过缩减步骤所需的时间来完成更快的扩增,而不影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于均有高扩增能力的DNA聚合酶,这种聚合酶在每次结合中可引入更多的核苷酸。

  八、长片段PCR (Long PCR)

  长片段PCR通常指扩增大于5 kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用Taq DNA聚合酶(为了快速延伸)和高保真酶(为了准确度)的混合物。

  九、定量PCR (Quantitative PCR)

  定量PCR分为绝对定量PCR及相对定量PCR。

  数字PCR为绝对定量,微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理,不依赖标曲及Ct值,无需标准品,不受扩增效率的限制。其将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴,其中每个微滴或不含待检核酸靶分子,或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后,逐个对每个微滴进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

  目前,采用较多的为qPCR相对定量法,主要是以表达量稳定的内参基因作为对照从而判断目的基因相对表达丰度。

  PCR引物设计原则:

  1、引物长度一般为15-30碱基,最好在模板cDNA的保守区内设计。

  2、G+C含量在40%~60%之间。

  3、碱基要随机分布。

  4、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

  5、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

  6、引物5′端可以修饰。

  7、引物3′端不可修饰。

  8、引物3′端要避开密码子的第3位。如果扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

  9、3’端最好不要是连续碱基,GGG或CCC会导致错误的引发。

  10、Tm值最好接近72℃,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。Tm值计算公式为:Tm=4(G+C)+2(A+T) (此公式试用于引物长度20mer及以下的引物)。更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为Tm=0.41(% of GC)-675/L+81.5   % of GC为引物GC含量(GC个数、引物总碱基数),L为引物碱基数。(计算公式是否附在此处。)

  11、引物5′端和中间△G值应该相对较高,而3′端△G值较低

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