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实验外包:Transwell实验步骤有几种

发布时间:2021-08-17 03:41:43 阅读:19512次 来源:本站

  本文主要介绍4种Transwell实验的实验步骤,具体包括:Transwell肿瘤细胞迁移实验、Transwell上皮细胞培养实验、Transwell B16细胞的体外迁移实验、Transwell内皮细胞HMEC-1迁移实验。

  一、Transwell肿瘤细胞迁移实验

  过程与Transwell侵袭实验基本一致,不同的只是不需要铺Matrigel。由于没有基质胶的阻挡,细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快,所以细胞量要更大。我做侵袭实验的细胞密度是1×105,而迁移实验的密度是1×106。另外,下层培养液的FBS浓度也可适当下调,侵袭实验的浓度是5%,迁移实验的浓度是2.5%。

  二、Transwell上皮细胞培养

  1. 将雄性wistar大鼠麻醉,开胸,将气管取出,置于4℃含0.1%胰蛋白酶XIV、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素、无Ca2+、无Mg2+、无血清的MEM。

  2. 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁,将所得溶液离心后得到游离细胞。

  3. 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶,再用含5%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100µg/mL链霉素的LHC-8 medium冲洗一次。

  4. 冲洗过后,将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力,若存活率大于90%,则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上(12mm),以37°C,5%CO?-95%空气,含5%胎牛血清,100 U/mL青霉素,100µg/mL链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

  5. 孵育后,经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间,即可用于电生理试验。显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片。

  三、Transwell B16细胞的体外迁移实验

  首先把Transwell倒置,在Transwell的PVPF膜(0.8µm)的下表面涂一层fibronectin(10 µg/mL,50µL),37度2小时,PBS洗一遍后,放入预先每孔加有600µL的培养基(含10%血清)的24孔板内,后在Transwell的内室加入细胞(100µL,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度),放入培养箱,12-18小时后,取出Transwell,用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞,另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟,结晶紫染色20分钟,用清水洗3遍以上,后在显微镜下观察细胞,记数。

  四、内皮细胞HMEC-1迁移实验

  1%明胶处理的Transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后,上室加入100µL用serum-free MCDB131稀释的5×10?/孔的HMEC及不同浓度的药物,下室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺激迁移,同时设置相应阴性及阳性对照,置于CO?培养箱中作用8小时,然后弃去孔中培液,用90%酒精常温固定30分钟,0.1%结晶紫常温染色10分钟,清水漂净,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,显微镜下观察并拍照,最后用10%乙酸100µL/孔抽提10分钟,于600nm处测定OD值。抑制率计算公式为:抑制率(%)=[(OD值给药组-OD值无刺激阴性对照)/(OD值不加药阳性对照-OD值无刺激阴性对照)]×100%。

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