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实验外包:Real Time PCR引物设计原则

2021-08-17 03:43:21
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  荧光定量PCR(Real Time PCR)引物设计目的是让目的基因按照理论值进行扩增,对非特异性反应和引物二聚体要求严格。

  相关教程:学会这一招,3分钟搞定qPCR引物设计

  Real Time PCR引物设计原则:

  ★扩增片段大小

  80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)

  ★Primer长度

  17-25 base

  ★GC含量

  40-60%(最好45-55%)

  ★★★Tm值

  两条引物的Tm值尽量接近,应用专用软件计算Tm值

  ★序列

  整体上碱基不能过偏

  个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端)

  避免T/C连续,A/G连续

  ★3’末端序列

  3’末端避免GC rich或AT rich

  3’末端碱基最好为G或C

  3’末端碱基尽量避免为T

  ★★★互补性

  引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列

  引物3’末端避免2 base以上的互补序列

  ★★★特异性

  使用BLAST检索,确认引物特异性

  ★★★RT-PCR用引物

  尽量在Exon junction上设计引物,限制基因组DNA扩增

  注:★表示重要程度,★越多表示越重要,设计时要优先考虑;此外,知恩生物还可以为您提供专业的荧光定量PCR(Real Time PCR)技术服务。


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