荧光定量PCR(Real Time PCR)引物设计目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。

　　相关教程：学会这一招，3分钟搞定qPCR引物设计

　　Real Time PCR引物设计原则：

　　★扩增片段大小

　　80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)

　　★Primer长度

　　17-25 base

　　★GC含量

　　40-60%(最好45-55%)

　　★★★Tm值

　　两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值

　　★序列

　　整体上碱基不能过偏

　　个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端)

　　避免T/C连续，A/G连续

　　★3’末端序列

　　3’末端避免GC rich或AT rich

　　3’末端碱基最好为G或C

　　3’末端碱基尽量避免为T

　　★★★互补性

　　引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列

　　引物3’末端避免2 base以上的互补序列

　　★★★特异性

　　使用BLAST检索，确认引物特异性

　　★★★RT-PCR用引物

　　尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增

　　注：★表示重要程度，★越多表示越重要，设计时要优先考虑；此外，知恩生物还可以为您提供专业的荧光定量PCR(Real Time PCR)技术服务。