荧光定量PCR(Real Time PCR)引物设计目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。
相关教程：学会这一招，3分钟搞定qPCR引物设计
Real Time PCR引物设计原则：
★扩增片段大小
80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)
★Primer长度
17-25 base
★GC含量
40-60%(最好45-55%)
★★★Tm值
两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值
★序列
整体上碱基不能过偏
个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’ 端)
避免T/C连续，A/G连续
★3’末端序列
3’末端避免GC rich或AT rich
3’末端碱基最好为G或C
3’末端碱基尽量避免为T
★★★互补性
引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列
引物3’末端避免2 base以上的互补序列
★★★特异性
使用BLAST检索，确认引物特异性
★★★RT-PCR用引物
尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
注：★表示重要程度，★越多表示越重要，设计时要优先考虑；此外，知恩生物还可以为您提供专业的荧光定量PCR(Real Time PCR)技术服务。
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