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贴壁细胞的培养及转染解析

发布时间:2023-05-02 10:36:55 阅读:12992次 来源:百度学术

  贴壁细胞的培养

  (1)贴壁细胞的复苏

  在准备进行细胞复苏实验时,应提做好一下两点准备:1.提把超净工作台紫外灭菌30分钟;2.提把水浴锅打开,使水温保持在37摄氏度,并预热复苏细胞所用的培养基。上述准备工作完成以后就可以从液氮中取出保存的细胞,本着“慢冻速融”的原则,把细胞放进水温37摄氏度的水浴锅中并不断搅拌,使冷冻的细胞迅速融化,,大限度的保存细胞的活力,这个过程,好在两分钟之内完成。细胞解冻后放在离心机中以1000 rpm的转速离心3-5分钟,离心结束小心弃去上清,并用提预热的完,全培养基把细胞吹打混匀,再转移至规格合适的培养器皿中,放入细胞培养箱培养即可。

  (2)贴壁细胞的传代

  当我们在准备给贴壁细胞进行传代的时候应该确认以下两点:1.先把细胞从细胞培养箱中拿出,放在显微镜下观察,确保细胞状态良好,没有污染;2.观察细胞的汇合度达到70%-90%,细胞汇合度太低或者太高时对细胞进行传代均不利于细胞生长。只有满足这两点基本条件,我们才能给细胞传代。给细胞传代时,先我们弃去培养基,用pH=7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗细胞2-3次,动作要轻柔防止细胞脱落。清洗完细胞后再加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞,消化过程中把细胞放在显微镜下观察,直到细胞被消化成一个一个单独的小圆球时加入完,全培养基终止细胞消化,消化时间要把握好,消化时间太短细胞没有消化下来,时间太长则会影响细胞活性。消化下来的细胞吹打混匀后以1:3-5的比例分装到新的培养器皿中再加入足量的完,全培养基继续扩大培养。

  (3)贴壁细胞的冻存

  冻存细胞时,先我们弃去培养基,用pH=7.4的无菌的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗细胞2-3次,动作要轻柔防止细胞脱落。清洗完细胞后再加入终浓度为0.25%的胰蛋白酶消化液消化细胞,消化过程中把细胞放在显微镜下观察,直到细胞被消化成一个一个单独的小圆球时加入完,全培养基终止细胞消化,消化下来的细胞吹打混匀后,按照以下比例混匀放入冻存管中:60%的胎牛血清(FBS)+30%细胞悬液+10%二甲基亚砜(DMSO)。特别值得注意的是,在冻存管上要标注清楚冻存的细胞名称,细胞冻存的时间,冻存细胞的代数等信息。本着“慢冻速融”的原则,我们把写好信息的冻存管放入慢冻盒中,放入负八十度冰箱冷藏十二个小时后再把细胞取出放入液氮中保存。

  贴壁细胞的转染

  在准备做细胞转染的一天我们把细胞铺进细胞培养皿中,加入完,全培养基培养24小时,使得细胞汇合度达到百分之六十到百分之八十。在转染需要把完,全培养基换成无双抗的完,全培养基,以排除双抗对转染效率的影响。根据转染的细胞数不同选取适量的纯培养基分别稀释质粒和lipo3000,其中稀释完的质粒中加入p3000充分混匀后再加入稀释过的lipo3000中,把混合液轻柔的吹打混匀,室温孵育20分钟。孵育结束后把质粒-p3000-lipo3000混合液加入细胞培养皿中,然后再轻轻摇匀,放入细胞培养箱中继续培养6个小时,再更换成带有双抗的完,全培养基即可。

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