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酵母细胞表面展示技术,系统基本组成和系统的类型盘点

2023-05-09 10:35:41
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  酵母细胞表面展示技术是一种真核蛋白表达系统,其利用酵母细胞表面展示系统(拥有完善的蛋白质翻译后修饰和分泌机制)将异源真核蛋白固定并展示在酵母细胞表面,已在蛋白质文库筛选、蛋白质定向进化、高亲和性抗体分选、抗原/抗体库构建、亲和力成熟、疫苗生产、免疫生物催化和生物传感器等多个领域应用广泛。

  酵母细胞表面展示技术的原理

  将外源靶蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞,然后利用酵母细胞内蛋白转运机制(GPI锚定)使靶蛋白表达并定位于酵母细胞表面。

  酵母细胞表面展示系统基本组成

  1.宿主细胞

  宿主细胞应具有无毒、容易培养、能和被展示的蛋白兼容共处及易于筛选的特点。酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物,此外巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母等,也是目前常见的用于酵母表面展示的宿主细胞。

  2.载体蛋白

  糖基磷脂酰肌醇(GPI)家族蛋白包括α-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p,Cwp2p,Tip1p等,均是常用的酵母表面展示载体蛋白,外源蛋白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面。

  3.外源表达蛋白

  外源靶蛋白序列中带有许多带电氨基酸残基或疏水性残基时将会抑制融合蛋白的分泌,其活性域的空间结构也会影响表达效果,因此选择外源蛋白时应根据实际的应用情况来决定。

  外源蛋白与载体蛋白的融合方式有C端融合、N端融合、插入融合。对某些外源蛋白,选择恰当的融合方式可以明显改善展示效果或蛋白的功能特性。

  酵母细胞表面展示系统的类型

  根据外源目的蛋白与酵母细胞壁融合部位的不同,酵母细胞表面展示系统可分为凝集素展示表达系统和絮凝素展示表达系统。

  凝集素展示表达系统

  凝集素展示表达是将外源基因与酵母编码α-凝集素的C端(320个氨基酸残基,含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游,融合蛋白诱导表达后,信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌,由于融合蛋白C-末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列,可将蛋白锚定在酵母细胞壁中,从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。

  凝集素系统又分为α-凝集素(Agα)系统和a-凝集素(Aga)系统。

  ● 在α-凝集素系统中,α-凝集素的C端可锚定在酵母细胞壁的葡聚糖上,外源蛋白作为N端与α-凝集素C端融合,在信号肽引导下分泌表达,从而实现了外源蛋白的展示表达。

  ● a凝集素由核心亚基(Aga1p)和结合亚基(Aga2p)组成。Aga1p共有725个氨基酸,它与酵母细胞壁的β-葡聚糖共价连接。Aga2p共有69个氨基酸,它通过两个二硫键与Aga1p结合。目的蛋白作为C端与Aga2p亚基的N端融合表达后,可通过Aga1p与酵母细胞壁共价连接而展示在细胞表面。

图例

絮凝素展示表达系统

  絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合,并将融合蛋白表达在细胞表面。

  絮凝素展示表达系统包括两个子系统:GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。

  ● GPI锚定系统是利用絮凝素Flolp的C-末端含有的GPI信号锚定外源蛋白,此系统与凝集素展示相似。

图例

  ● 絮凝功能结构域锚定系统是利用Flolp的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合,通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁汇总的甘露聚糖链,诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。

图例

酵母细胞表面展示技术的特点

  表达偏量小。

  融合蛋白相对分之质量范围大。

  融合蛋白分子数量多。

  筛选、纯化、活性测定方便。

  酵母细胞表面展示技术的应用

  酒精发酵:Fujita等利用α-凝集素展示系统,成功地将三种纤维素水解酶同时展示在酿酒酵母表面,最终可以直接把无定形纤维素转化成乙醇。

  新药筛选:将未知功能目的的基因产物或特定病理过程相关蛋白产物展示在酵母表面,然后对cDNA表达文库或突变体库进行筛选,能发现与这些未知功能的基因或病理过程相关产物发生相互作用的物质,有助于对未知基因功能的研究,或筛选治疗疾病的新药先导化合物。

  生物吸附:利用酵母细胞表面展示系统能够将重金属或某些有机化工原料等直接展示在表面,最终达到生物修复环境污染物的目的。

  抗原表面展示:将抗原蛋白展示在酵母细胞表面,可使其更接近天然的空间构象,从而能够对其进行ELISA等血清学检测。

  其他方面:蛋白质分子的相互识别,定向进化及酶的固定化等方面。

  参考文献

  [1] Fujita, Y, Ito, J, Ueda, M,等. Synergistic Saccharification, and Direct Fermentation to Ethanol, of Amorphous Cellulose by Use of an Engineered Yeast Strain Codisplaying Three Types of Cellulolytic Enzyme[J]. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(2):1207-1212.

  [2] 叶波, 林影, 韩双艳. 酵母细胞表面展示系统的研究进展及其应用[J]. 工业微生物, 2007, 37(06):56-61.


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