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细胞凋亡检测方法有哪些

2022-12-26 10:35:58
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  细胞凋亡是指细胞在正常生命周期结束时通过特定的信号通路自然死亡的过程。细胞凋亡是调节细胞生长、发育和更新的重要机制,在生物体内的多种组织中都发挥着重要作用。

  一、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法

  原理:正常细胞膜的磷脂分布是不对称的,活细胞中磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PS)位千细胞膜的内表面,细胞凋亡时,细胞膜发生变化, PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白,Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS, 而活细胞的PS位千细胞膜的内表面,无法与Annexin V特异性结合。所以可以用FITC偶联的annexin V鉴别凋亡细胞和活细胞。

  坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面,Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS, 所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合,区分坏死细胞和活细胞。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整, PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合,所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞,而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合,坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光,被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用,就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。

  二、线粒体膜电位检测

  原理:JC-1是亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。正常生理状态下,线粒体负电性高,JC-1进入线粒体以多聚体存在,红色荧光强,细胞凋亡时,线粒体去极化产生,负电性降低,JC-1则以单体存在细胞质,绿色荧光增强。

  三、TUNEL法

  原理:TUNEL的全称是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling,中文名为末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记。

  细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30%的染色体DNA在Ca²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180~200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。

  由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色。低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译(nick translation),使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞。

  TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

  四、ISOL检测法

  原理:与TUNEL凋亡检测法类似,ISOL(In Situ Oligo Ligation,原位寡核苷酸片段连接)也是通过末端标记断裂DNA的方法。但该方法的创新在于利用ISOL方法,在DNA片段的平端或3’端单个突出碱基进行连接扩增,鉴于只有发生凋亡的细胞才会发生平端或3’端单个碱基突出,所以ApopTag 过氧化物酶ISOL凋亡检测试剂盒能够明确的区分凋亡细胞和坏死细胞。

  五、DNA凝胶电泳(DNAladder)

  凋亡过程中DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程,DNA凝胶电泳也曾被认为是细胞凋亡判定的金标准之一。抽提细胞的DNA,确定样品中DNA的量和纯度,然后在琼脂糖凝胶上电泳。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带;细胞凋亡时,由于DNA被裂解成单个核小体和寡聚核小体,电泳时呈现特征性的“阶梯状”(ladder)条带,坏死细胞的DNA是被随机破坏的,不能形成阶梯状条带,电泳时出现类似血涂片的连续性改变。此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方法,比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测。

  六、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定

  ELISA是定量检测细胞凋亡的免疫化学法,其基本原理是利用夹心ELISA方法检测细胞凋亡后形成的由组蛋白及DNA片断组成的核小体。在微定量板上吸附抗组蛋白抗体,加入细胞裂解后离心所得的含有核小体的上清液,核小体上的组蛋白与包被的抗组蛋白抗体结合;加入辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体,与核小体上的DNA结合;加酶的底物,测光吸收值。此方法敏感性高,所需细胞数少,可检测低至5×102/mL的凋亡细胞。此外,此方法不需特殊仪器,比较适合基层工作。

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