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qPCR荧光定量PCR的Ct值多少比较好,Ct值过大或过小的解决方法

2022-12-12 10:38:49
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  Ct值是荧光定量PCR重要的结果呈现形式。它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大可被认为是合理?如何保证Ct值的有效范围呢?今天就让小编来为大家解答这个问题。

  Ct值是什么?

  qPCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Cycle Threshold)。C代表Cycle,T代表Threshold。简单讲,Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时,所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。

  Ct值有什么作用?

  1.指数扩增、模板量与Ct值的关系

  理想情况下,qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累,扩增循环数和产物量之间的关系是:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数。然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下,当扩增产物量达到“一定产物量”时,此时循环个数为Ct值,处于指数扩增时期。Ct值与起始模板量的关系:模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。

图例

  2.扩增曲线、荧光阈值与一定产物量

  qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现,也就是扩增曲线。在PCR早期,扩增处于理想情况下,循环数较少,产物积累少,产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别,之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量,以此作为“一定产物量”,并且由此来推断模板最初的含量。因此,一定产物量对应的荧光信号强度,也就是荧光阈值。

  在PCR的后期,扩增曲线不再呈现指数扩增,进入线性期和平台期。

  3.Ct值的重现性

  PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期,此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。

  Ct值的范围?

  1.扩增效率En

  PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析,简要介绍下影响扩增效率的因素。

  2.Ct值的范围

  Ct值的范围为15-35。Ct值小于15,认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值。理想情况下,Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,也就是标准曲线。通过标准曲线,扩增效率为100%时,计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右,若大于35,理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义。

  对于不同的基因Ct范围,因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同,需做出该基因的标准曲线,计算出基因的线性检测范围。

  3.Ct值的影响因素

  由扩增循环数和产物量之间的关系:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数,可以看出,在理想条件下,起始模板量和En会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。

  4.Ct值过大或过小

图例

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