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MTT实验步骤及注意事项

2023-03-14 10:38:43
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  MTT全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT法,又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

  MTT细胞实验步骤

  1、细胞种板:将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化,配制成浓度为1-10×104个/ml的细胞悬液,按10000细胞/孔接种于96孔板,每孔加100μl,置于CO2(5%)培养箱中37℃下培养24h以贴壁。

  2、加药处理:继续培养0h、12h、24h、36h分别更换为100μl细胞样品各自对应的含有浓度药物的培养基,对照组更换为含溶剂的培养基,分别记为药物处理48h、36h、24h、12h。每个样本浓度设三个重复。

  3、MTT反应:所有孔中加入20μl 浓度为5mg/ml的、新鲜配制的MTT溶液,培养箱中孵育4小时,使MTT还原为甲瓒(此时倒置显微镜下可看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体)。

  4、DMSO溶解甲瓒:小心的吸除上清液,每孔加DMSO(二甲基亚砜)150μl,用摇床摇匀。

  5、测吸光度值:使用酶标仪测定570nm光吸收值,以溶剂处理细胞为对照组,按公式计算药物对细胞的抑制率。

  抑制率=1-(实验组-空孔)/(对照组-空孔)


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