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包涵体蛋白复性方法

发布时间:2022-07-27 10:27:53 阅读:13392次 来源:百度学术

  原核表达中因为各种内在和外在因素,外源蛋白表达过程中多数会形成不可溶形式的包涵体。由于包涵体产量高、稳定性好、容易纯化等,包涵体蛋白已成为规模化制备蛋白产品的重要途径。包涵体虽然有如此好的优点,但却没有生物活性,为了达到这一重要目标,各种复性机理及策略被研发出来,但是往往没有一种通用的策略,而是需要结合表达蛋白的性质进行多次的尝试才能获得成功。

图例

  图片来自麻省理工学院The Jonathan King Lab http://web.mit.edu/king-lab/www/research/Scott/Scott-Research.html

  复性包涵体通常的步骤是洗涤—溶解—复性:洗涤去除了包涵体中的杂质后基本能得到高纯度的重组蛋白,再用强变性剂进行溶解,此时用到的多数是高浓度的尿素或盐酸胍,最后进行各种方法的复性,将强变性剂的浓度尽可能降低,得到有正确空间结构的重组蛋白。

  复性常用的经典方法有三类:稀释复性法(使用率最高)、透析复性法、超滤复性法。随着技术的发展,许多新型方法也被开发,如高流体静压复性法(HHP)、色谱法、高压复性法、反胶束复性法、沸石复性法、多壁碳纳米管复性法、三相分离复性法等。

  复性就是用外界方法促进蛋白进行正确折叠的过程,那么到底是什么影响了蛋白在复性过程中的折叠呢?研究表明,复性成功与否的主要影响因素还是蛋白质的自身性质,如等电点、分子内二硫键、蛋白的二级结构组成等。

  1、等电点。蛋白的等电点pI值等于能让其解离成阳离子和阴离子的程度相等使分子呈电中性的溶液pH值。当蛋白所处溶液pH=pI时,蛋白呈电中性,容易形成不稳定态聚集析出。在常规的盐酸胍/尿素溶解的包涵体复性过程中,pI值小于6.0的蛋白更易被成功复性。

  2、分子内二硫键。如果蛋白复性时能形成正确的二硫键,对复性的成功率会有很大的改善。因为大肠杆菌胞内的还原环境会抑制二硫键形成从而形成大量错配的二硫键,所以对于有二硫键的蛋白在复性过程中需要加入氧化还原对(通常采用GSSH/GSSG)来控制复性的环境的氧化还原电势以促进正确二硫键的形成。

  3、蛋白的二级结构。蛋白的二级结构组成对复性过程也有一定程度的影响,但是不是主要因素。例如α螺旋和β折叠的比例增加会对复性的回收率产生不利影响,而转角结构的比例增加则会起到一定的促进作用。

  另外,环境因素对复性过程也有一定影响,对不同的蛋白进行不同条件的组合尝试是很有必要的。

  1、蛋白的浓度。复性的过程可以用如下的公式表示,其中D为变性蛋白,I为折叠中间体,N为天然构象蛋白,A为聚合体。反应①通常很迅速,反应②比较慢是折叠过程的限速步骤,反应③是不可逆的二级反应,在复性过程中需要尽量使变性蛋白浓度降低能,尽可能降低反应③的速率从而促进蛋白的正确折叠。

  2、复性缓冲液pH。通常复性缓冲液的pH在7.0以上,如此可防止自由硫醇的质子化影响二硫键的正确配对,以8.0~9.0最为合适;

  3、复性温度。复性过程中反应温度越高反应速率越快,会提高蛋白复性的速率,而由此引起的二硫键易错配、聚集体容易大量形成也会大大降低复性蛋白的活性及复性回收率,故复性温度一般选择在常温或更低的温度。

  4、复性时间。相对而言,结构越复杂、分子间次级键越多越复杂的蛋白,需要越长的复性时间使其形成正确的折叠。

  复性过程一般会加入一些常规物质辅助复性,如氧化还原对(通常采用GSSH/GSSG)、低浓度尿素等,其他一些类型如低浓度变性剂、氨基酸、糖类、表面活性剂、多聚物、蛋白的辅因子、分子伴侣等物质也可促进包涵体的复性。

  1、低浓度变性剂如尿素、盐酸胍可以有效防止变性蛋白的分子间疏水作用力,从而抑制聚集体的形成。

  2、L-Arg可以特异性结合于错配二硫键及错误的折叠结构,使错误折叠的分子变得不稳定推动其向正确折叠的方向进行。

  3、糖类如环糊精与分子伴侣有相似的构象,具有疏水性空腔,可结合变性蛋白多肽链的疏水性位点从而抑制其聚集失活,促进蛋白进行正确的折叠。

  4、表面活性剂可以捕获非天然状态的蛋白形成复合物,起到阻止蛋白凝聚的作用,从而抑制折叠中间体的聚集,如SDS、磺基甜菜碱,但SDS只适用于某些蛋白,对某些蛋白的复性可能会起到不利的作用。

  5、一些多聚物如PEG具有脂肪链结构,它可以通过结合到折叠中间体的非极性区域来组织中间体的聚集,从而促进蛋白的复性。

  6、蛋白的辅因子如二价离子Zn2+、Cu2+可通过稳定折叠中间体从而促进蛋白的复性。

  7、分子伴侣是原核和真核生物自身能表达的一类促进蛋白折叠的蛋白,分子伴侣的添加或共表达可促进外源表达蛋白的正确折叠,分子伴侣主要通过结合蛋白的疏水性区域,防止蛋白形成聚集体和错误配对。

  包涵体蛋白的复性方法选择和添加物的选择,应结合蛋白本身的性质。例如对不含二硫键的蛋白复性体系中可加入DTE(Dithioerythritol),对于含二硫键的蛋白需加入氧化还原对如3 mM还原型和1 mM氧化型谷胱甘肽。对处于活性态时需要金属离子的蛋白进行复性时则要避免体系中加入EDTA等螯合剂,而需要添加对应的金属离子。另外,对包涵体蛋白进行复性是一个很复杂的过程,对某些外界条件需要进行逐步优化,多次尝试才能得到最好的复性产率。

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1414.html

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