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质粒提取实验会遇到哪些问题(质粒提取实验避坑指南)

2022-07-05 10:41:09
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  相信大部分同学进入实验室第一接触的实验就是质粒提取,虽然质粒提取实验相对简单,但是还是有很多问题需要我们提防和解决的。

质粒提取实验会遇到哪些问题(质粒提取实验避坑指南)

  质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介,常用的方法有煮沸裂解法、碱提法等。而我们常用的 kit 是采用碱提法

  不同品牌的试剂盒具体操作步骤可能不同,但这个万变不离其宗,基础知识点还是不变的。菌体在强碱性条件下裂解,释放出包括质粒在内的核酸,蛋白等物质。pH恢复中性时,共价闭合环状质粒 DNA 复性快,而线性的染色体 DNA 复性缓慢,细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体 DNA 会相互缠绕成大型复合物,而后者被十二烷基硫酸盐包盖。

  当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心除去变性剂后,就可以从上清中回收复性的质粒 DNA。

  质粒提取实验会遇到的问题

  1. 未提出质粒或提取质粒得率低

  1)提取质粒的甘油菌使用错误对应抗性的培养基培养

  2)菌体质粒拷贝数低或无质粒,菌质粒拷贝数低往往提取的质粒含量低,某些菌体在多次转接后可能出现质粒丢失的情况

  3)碱裂解时间不充分,导致裂解不彻底,菌体中质粒未全部提取

  2. 基因组污染或蛋白质

  1)加入裂解液时摇晃剧烈及裂解时间过长,菌体基因组未与菌体蛋白质,细胞壁相互缠绕形成复合物并与十二烷基硫酸盐结合成沉淀

  2)离心白色絮状物时间不充分,导致上清液并不澄清混有蛋白质

  3)不要使用过多菌体,导致上清液不够澄清

  3.质粒降解

  1)质粒提取完成后避免反复冻融

  2) 质粒溶解时吹打混匀时避免吹打过力,造成机械损伤

  3)最后溶解质粒时应在超净工作台避免引入核酸酶造成质粒降解。

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