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稳转株构建方法?影响稳转株建立的因素有哪些

发布时间:2022-07-05 10:37:00 阅读:11142次 来源:海星生物

  什么是稳转株?

  稳转株即稳定表达的细胞株,指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。

  为什么要建立稳转株?

  ① 通过建立稳转细胞系,可以降低频繁转染或者病毒包装的成本,方便在目的细胞中研究基因功能实验研究;

  ② 区别于瞬时转染只能干扰表达,无法去除已表达的目的蛋白,构建稳转细胞系可以实现更好的基因干扰效果;

  ③ 瞬转会引入极高拷贝数的表达,导致因人为因素造成实验结果的不精确,建立稳转细胞系可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究;

  ④ 需要用诱导表达系统的,主要是一些致死基因或者是需要时空表达的。

  稳转株构建原理

  通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上,重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中,并能随细胞分裂稳定传递下去,再用载体中所含抗性基因进行筛选。

  稳转株构建方法

  目前常用到的方法有脂质体转染和病毒转染,病毒有慢病毒(Lentivirus),腺病毒(Adenovirus),逆转录病毒(Retrovirus)。

图例

  影响稳转株建立的因素

  ① 外源基因的整合率:决定了稳转株筛选的难易程度;

  ② 插入外源基因片段的拷贝数:通常低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰;

  ③ 整合位点的转录活跃度:决定了稳转株中外源基因片段的表达质量;

  ④ 外源基因片段整合到细胞后的稳定性:不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性,有些区域易发生重组或者丢失,从而使稳转株筛选后出现丢失的现象。

  稳转株建立步骤

  | 病毒法

  ① 确定目标细胞系的相关信息,细胞的培养条件,细胞的增值速度,支原体污染情况;

  ② 预实验确定MOI值,可通过查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI值也可参考查阅得到的数据,设计梯度实验,摸索最适MOI;

  ③ 预实验确定筛选药物用量,常用的药物筛选有:puro、G418、潮霉素等;

  ④ 细胞铺板,将需要的细胞量接种于合适的培养皿中;

  ⑤ 细胞感染,通过接种的细胞量及预实验得来的MOI来计算添加的病毒体积;

  ⑥ 撤病毒,第二天,一般不超过24h换液;

  ⑦ 转染48h后选择对应的抗性药物进行筛选;

  ⑧ 筛选结束后进行单克隆化,选择阳性克隆进行培养。

  | VIRUS-Free™技术

  VIRUS-Free™ 是一种利用转座子系统进行细胞稳转株的构建和筛选的技术,以替代慢病毒感染构建稳转细胞株的技术。其载体中包括了转座子的识别区域,在转座酶的催化下,将目的片段从载体上或者BAC分子上切割下来形成一个小环结构,并在基因组里面的固定序列位置进行插入,从而实现稳转。目前已经在CAR-T细胞治疗中得到较多的临床应用,并充分体现出其:低成本、高效率、基因表达稳定的特点。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1336.html

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