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单细胞凝胶电泳操作规程

2022-12-04 10:33:40
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  一、编号:JS0603

  二、标题:单细胞凝胶电泳操作规程

  三、关键词:单细胞凝胶电泳 操作规程

  四、目的:规范单细胞凝胶电泳的操作,提高单细胞凝胶电泳试验结果的可比性。

  五、背景知识:单细胞凝胶电泳分析(single cell gel eletrophoresis,SCGE)是由Ostling等(1984)首创,后经Singh等(1988)进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,适用于多种细胞,能够灵敏地检测DNA断裂,在检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面有广泛的应用价值。因其细胞电泳形态颇似彗星,又称彗星实验(comet assay)。

  六、原理:在细胞核中,DNA是环状附着在核基质上,细胞裂解过程中,核基质被溶解、抽提,DNA的结构则未发生变化。如果DNA链上存在缺口,则使DNA超螺旋变的松弛,DNA环向外展,同时由于暴露了阴电荷,在电场力的作用下,松动的DNA环向阳极迁移,但是由于这种松动的DNA环一端仍附着于核DNA,其迁移距离受到限制,因此尾长并不总是真实反映链缺口的多少。实际应当依靠尾长与尾部的荧光强度同时来进行分析。

  七、仪器设备和材料:琼脂糖,低熔点琼脂糖,磨沙载玻片,水浴锅,碘化丙啶(Sigma),电泳仪,水平电泳槽,荧光显微镜(BX60,奥林巴斯)。

  八、操作步骤

  1、分离制备单细胞悬液

  (1)体外培养的细胞株:用胰酶消化,吹打成单细胞悬液。

  (2)体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hank’s液中制备成单个细胞悬液。

  2、胶板制备

  (1)取20~50μl于56℃水浴中保温的0.5%普通熔点琼脂糖,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。

  (2)取100~150μl 0.5%普通熔点琼脂糖加在底胶上,再于其上加盖玻片,4℃冷凝10分钟。

  (3)取下盖片,取50~100μl于37℃水浴中保温的1.0%的低熔点琼脂糖与50~100μl细胞悬液(105个细胞/ml)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4℃冷凝10分钟。

  (4)去掉盖玻片,取70~100μl于37℃水浴中保温的0.5%的低熔点琼脂糖铺片,加盖玻片,4℃冷凝。

  3、细胞裂解与电泳

  (1)将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,4℃裂解1小时。

  (2)取出胶板,放入电泳槽中,浸泡在电泳液中解旋20分钟。

  (3)4℃电泳20分钟(25V,300mA)。

  4、中和与染色:

  (1)电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次15分钟,共中和两次,注意更换中和液。

  (2)取出胶板,置于染色架上,滴加5μg/ml的PI,暗处染色20分钟。

  (3)蒸馏水脱色15分钟。

  5、镜检和分析:

  (1)在荧光显微镜下观察,绿光激发吸收滤片590nm,必要时照相记录。

  (2)记数观察的细胞,记录彗星细胞出现的频率,用目镜测微尺测头长与全长,计算核DNA迁移距离。


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