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gfp融合蛋白载体构建(附GFP的优缺点及改进方法讲解)

2023-05-11 10:48:50
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  GFP(绿色荧光蛋白)是从水母体内发现的发光蛋白,分子质量为26kDa,由238个氨基酸构成。实验室中常用的重组GFP标签更接近水母的GFP,其分子量为27kD左右。

  GFP本身是一种酸性、球状、可溶性天然荧光蛋白。按一定规则,11条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏;α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。

  GFP的发光机理

  物质基础:GFP的生色团

  由65~67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸(Ser-Tyr–Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮,形成生色团。

  GFP发出荧光稳定,无需再添加任何底物和辅助因子,在紫外或蓝光激发下就能发荧光。在450~490nm蓝光激发下,GFP荧光至少能保持10min以上。适合于活体检测,在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强。

  GFP生色团的形成没有物种特异性,可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。

  发色团上的共轭 π键能吸收激发光能量,在很短的时间后,以波长更长的发射光释放能量,形成荧光。

  例:GFP在水母中能发光,是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

  GFP的荧光特性

  GFP的最大吸收峰为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰。

  GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)相似,所以GFP观察可用荧光显微镜滤光片组合。

  GFP需在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式。

  GFP的优缺点及改进方法

  GFP的优点

  易于检测,灵敏度高;

  荧光稳定;

  对细胞无毒害作用;

  广谱通用性;

  易于构建载体;

  可进行活细胞实时定位观察;

  易于得到突变体;

  不受假阳性干扰。

  GFP的缺点

  尽管GFP作为分子探针具有多种优点,但野生型GFP仍具有一定缺点:

  GFP有两个激发峰影响特异性,且长波激发峰强度较小,不易观察;

  GFP合成及折叠产生荧光的过程慢,蛋白质折叠受温度影响大,表达量较低;

  GFP在某些植物细胞中不表达。

  改进方法

  ①除去GFP基因中隐蔽型内含子;

  ②消除编码蛋白的积累;

  ③将GFP定位到特定细胞器中;

  ④改变碱基组分;

  ⑤更换GFP生色团氨基酸;

  ⑥插入植物内含子;

  ⑦增加增强子和更换强启动子。

  GFP融合蛋白的构建

  应用亚克隆技术将目的基因与GFP基因构建成融合基因,通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞,利用目的基因的表达调控机制,如启动子和信号序列来控制融合基因的表达,最终得到融合蛋白(尽可能不影响目的蛋白的定位和功能)。

  目的蛋白与GFP基因融合方式:

  目的基因-GFP(将GFP置于目的基因之后)

  GFP-目的基因(将GFP置于目的基因之前)

  注意事项:

  两个基因之间用Linker连接;

  在两个基因交接处增加一段核苷酸(3的倍数)使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较小,有利于GFP发光;

  基因在GFP之前时必须要有起始密码,不能有终止密码;基因在GFP之后必须有终止密码;

  构建融合基因后,必须测序进行验证,确保融合基因读框正确之后才能进行后续研究。

  GFP融合蛋白的检测

  定性检测:可以用常规的落射荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察;

  定量检测:免疫印迹法,酶联免疫吸附法;

  可以在活细胞中进行图像分析,也可以检测固定细胞中的GFP。

  注意事项:

  以GFP作为报告基因研究蛋白亚细胞定位,必须作对照。必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光,以免假象干扰;

  构建正确的融合基因不一定都能正常表达,要尽可能多的获得转基因细胞。


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