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冰冻切片免疫荧光染色步骤(冰冻切片免疫荧光实验步骤)

发布时间:2022-03-09 10:40:27 阅读:126442次 来源:医学方

  观察组织中目的蛋白的定位,一般可以选择冰冻切片进行免疫荧光。冰冻切片制作时间短,操作过程简单快捷,同时获得的免疫荧光图片相对于免疫组化图更加漂亮。

  冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。用高分子材料配制成冰冻切片包埋液,将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘上加少许包埋液,在其固化前嵌入组织块,然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。

  冰冻切片过程较简单,切片厚度一般可在6-8微米,组织没有收缩,易保持生活时原有状态。

  免疫荧光技术亦称荧光抗体技术,应用化学方法将荧光色素(主要是异硫氰酸荧光黄FITC)与抗体结合起来,即荧光抗体,这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变。在特定条件下用荧光抗体染标本,如果标本中存在有相应的抗原,荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合,在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下,标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光,荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在。免疫荧光特异性强、敏感性高、速度快。

  今天就为大家介绍一下冰冻切片免疫荧光染色流程。

  冰冻切片免疫荧光染色流程

  1. 冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片,多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的,主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。冰冻切片之后如果不即时染色,可将片子放于负八十冰箱。再次取出后可先在室温晾干15分钟。然后置PBS中浸泡10分钟,以去除OCT;
冰冻切片

  2.用组化油笔将待染组织圈好,目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围,使抗体进行有效的孵育;

  3.0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤).(4)用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时(此步可以不洗涤,把封闭液吸干)封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景;

  4.加入一抗(1:100-1:500),4℃孵育过夜。一抗的浓度可以使用抗体的推荐浓度,或可根据抗体的质量选择合适的浓度;

  5.PBS洗3次,每次10分钟;

  6.加入荧光标记的二抗(1:200),37℃孵育1小时,此时注意要进行避光操作。常用的荧光素有FITC(呈现明亮的黄绿色荧光)、rhodamine(呈现明亮的橙红色荧光);

荧光

  7.PBS洗3次,每次10分钟;

  8.用羊血清稀释DEPI(1:1000),避光孵育5min,目的是染细胞核,10分钟。除了DEPI进行细胞核染色外,也可以选用Hoechst染色,一般为蓝色荧光;

  9.PBS洗3次,每次10分钟;

  10.滴加防荧光淬灭剂之后进行封片,封片时有一个小窍门,即在载玻片的四周点指甲油,可以有效地黏结盖玻片与载玻片。封片结束后,通过荧光显微镜观察结果并拍照;

  冰冻切片免疫荧光注意事项:

  1.整个实验过程中勿使表面干燥。

  2.稀释、加二抗(荧光抗体)及此后的洗涤过程中注意避光。

  3.冰冻切片进行免疫荧光之后,需要尽快拍照,防止免疫荧光淬灭。

  4.在进行荧光显微镜拍照时,要根据荧光抗体选择合适的激发光源。


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