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重组蛋白表达异常怎么解决(解决方案)

2023-02-20 10:39:34
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  1. 方案设计问题

  1.1 密码子移位:翻译起始mRNA与插入片段序列形成二级结构,外源基因序列内部有核糖体结合位点、SD序列或者其他干扰性元件。

  1.2 稀有密码子问题:可以使用相关软件分析稀有密码子问题,建议有条件的实验室进行重组蛋白表达前密码子分析优化;起始位点前15个氨基酸的密码子对表达至关重要;连续2个稀有密码子可能导致表达效率大大降低。

  1.3 真核蛋白信号肽问题:大肠杆菌缺乏加工真核蛋白信号肽的机制。

  1.4 GC含量太高:一般GC含量超过70%都是难于表达,通过基因优化降低GC含量。

  1.5 蛋白大小问题:一般小于10kD或者大于100kD蛋白都是难于表达。

  1.6 标签蛋白的选择:

  在尽可能不影响目标蛋白结构的情况下,选择合适的标签,通过标签蛋白的高产量强启动表达带动目标蛋白的表达。

  2. 操作过程问题

  质粒构建,表达工程菌使用等失误造成。

  2.1 质粒构建完之后,除了普通的酶切鉴定和PCR鉴定外,必须测序确认,无任何突变,更不能多余或者缺失碱基,确认外源片段插入后读码框与载体步调完全一致。

  2.2 表达宿主菌首先必须确认标准有效,必须与载体质粒配套,比如,我们配合pET系列载体T7启动子的表达菌是BL21(DE3),而不是BL21,同时必须清楚知道整个体系的操作,比如,Rosetta(DE3)菌使用时必须额外添加氯霉素,否则,其额外携带的助表达质粒容易丢失;比如,含CspA启动子的载体,诱导剂不是IPTG,而是降低温度。不是所有的表达诱导都是用IPTG来完成的。

  3. 蛋白容易降解问题

  宿主菌体内的很多的蛋白酶将重组蛋白降解了,特别是N-端是Arg、 Leu、Lys、Phe、Trp,或Tyr时,这就是N-末端规则;C-末端5个氨基酸是非极性氨基酸也容易被降解。这些蛋白即使表达,如果快速降解了,也很难检测到目的蛋白。

  4. 培养基问题

  很多在LB培养基中不表达的重组蛋白,更换了TB或2×YT培养基后表达成功。

  5. 重组蛋白有毒性或者影响宿主菌生理功能

  对于这类蛋白应考虑更为严谨的表达载体系统。

  6. 蛋白痕量或者表达带与宿主菌自身蛋白某高浓度带重叠

  建议用标签抗体的Western Blot进行确认。

  7. 分子量异常问题

  有些蛋白的分子量与预期有偏差,SDS-PAGE电泳是结合电荷/电场与聚丙烯酰胺凝胶孔径分析蛋白质分子量,如果蛋白质本身氨基酸组成不符合均态分布规律,会造成在SDS-PAGE胶中迁移异常,比如P53蛋白,实际分子量只有40多kD,其电泳显示为53kD,后经过分析,其序列内部含有大量的Pro,更多的实例也表明内部富含pro的蛋白序列会造成蛋白在SDS-PAGE电泳中迁移率显示偏大。实验时需要仔细比对诱导/非诱导菌体蛋白带谱差异,结合Western Blot和纯化数据做出判断,必要时可进行质谱确认。

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