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染色质免疫共沉淀的方法

发布时间:2022-12-04 10:40:10 阅读:17192次 来源:百度学术

  目前,不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。今天跟大家分享的是花样百出、拽酷炫的染色质免疫共沉淀的方法!

  染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,  CHIP)原理

  值得注意的是,它是目前*个研究体内 DNA与蛋白质相互作用的方法。在生理状态下,把细胞内的 DNA 与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的 DNA 片段沉淀下来,以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的 DNA 片段,再通过多种下游检测技术(定量 PCR、基因芯片、测序等)来检测此富集片段的 DNA 序列。

  染色质免疫共沉淀技术包括 3 个独立的步骤,即固定、沉淀和检测。

  第 1 步为固定,即在体内用甲醛固定 DNA 和蛋白质复合物,然后用化学(微球菌酶)或者机械(超声波)的手段将其随机切成一定长度的染色质小片段(200~1000bp)。

  第 2 步为免疫沉淀,即利用目的蛋白质或者目的蛋白质上标签的特异性抗体,通过抗原和抗体反应形成 DNA-蛋白质-抗体复合体,然后沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段。

  第 3 步为目的片段的纯化与检测,即经过热处理解交联,释放共沉淀的 DNA;再将 DNA 片段纯化后,对沉淀的 DNA 样品进行检测。

  目前检测方法主要有 3 种:

  染色质免疫共沉淀-qRT(ChIP-qRT)

  第 1 种是比较沉淀的模版与阴性和阳性对照信号强度的相对精确的定量 PCR 方法。有关这个方法,跟其他两种相比,只想送给爱学习爱动手的小伙伴四个字:成本较低!

  染色质免疫共沉淀芯片杂交(ChIP-chip)

  ChIP 和 DNA 微阵列芯片技术的结合是一种高通量分析 DNA 和蛋白质结合或者翻译后染色质/组蛋白修饰的方法。具体方法是:将经过染色质免疫共沉淀的 DNA 样品纯化后进行 PCR 扩增,然后用荧光素标记(如 Cy3)。对没有经过免疫沉淀反应富集的 Input DNA 样品也进行扩增,并且用另一种荧光素标记(如 Cy5),作为结合背景的参照。之后将这两种 DNA 杂交于包括基因组序列的微阵列芯片上,转录因子结合的靶序列用每个点相应的荧光强度来确定。

  染色质免疫共沉淀测序法(ChIP-seq)

  在测序深度和范围足够的情况下, ChIP-seq 可以检测到所有的组蛋白修饰所对应的 DNA  结合位点。ChIP-seq 首先通过染色质免疫共沉淀技术特异地富集目的蛋白结合的 DNA 片段, 并对其进行纯化与文库构建,然后以 NGS 技术对富集到的 DNA 片段进行高通量测序。

  【NGS 技术主要是利用 DNA 新模板的合成或连接过程, 用高效平行的方式同时对 DNA 模板进行测序, 从而获得大量的测序数据, 即所谓的大规模平行测序。】

  尽管染色质免疫共沉淀看上去似乎很高大上,但真正掌握其原理和方法之后其实也不难。何况它的后续检测并不都是 chip 和 seq 这些高消费的方法,也可以采用接地气的 qRT-PCR,小伙伴们可根据自己的情况作出选择。


本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1844.html

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