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WB实验全过程和步骤

发布时间:2022-12-05 10:25:44 阅读:11232次 来源:丁香园

  一、实验步骤详解

  (一) 配胶

  1. 洗玻璃板:用洗洁精洗净,再用蒸馏水冲洗后,使用无水乙醇进行润洗,放置,自动晾干(或使用吹风机吹干)。

  2. 配置分离胶:制备 5 ml/gel的分离胶,用合适规格的移液枪吸取 1.9 ml/gel DDW、1.7 ml/gel 30% Acr-Bis(29:1)、1.3 ml/gel 分离胶缓冲液、0.05 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED 于 EP 管,使用震动仪混匀后放置通风橱。

  3. 安装制胶架:将玻璃短板和长板置于制胶架,注意将两块板下层对齐,卡紧,移至通风橱用以注胶。

  4. 注入分离胶:用胶头滴管吸取分离胶,小心注入,直至分离胶上缘至长板上缘2 cm左右处,顶层注入无水乙醇,等待30 min后凝胶,倒出无水乙醇。

  5. 配置浓缩胶:制备 2 ml/gel的分离胶,用合适规格移液枪吸取 1.15 ml/gel DDW、0.33 ml/gel 30% Acr-Bis(29:1)、0.5 ml/gel 浓缩胶缓冲液、0.02 ml/gel 10% APS、0.002 ml/gel TEMED于EP管,使用震动仪混匀后放置通风橱。

  6. 注入浓缩胶:用胶头滴管将浓缩胶注入预留好的 2 cm空隙,小心插入加样梳,注意不要残留气泡,等待 30 min凝胶。

  (二) 上样与电泳

  1. 将玻璃板从制胶架拿出,放入提前洗净的电泳槽内固定,垂直拔出梳子,在内槽加入足够电泳液,冲出加样孔内的气泡,根据所需上样量,使用相应的移液枪在上样孔加入样品及 marker。

  2. 上样完毕后,在外侧电泳槽加入电泳液至相应刻度处(2 板或者4 板),盖上电泳槽的盖子(注意正负极)。

  3. 打开电源,于 80 V电压下电泳,等待样品下缘齐平后调至 120 V,等待大约 90 min 溴酚蓝跑至即将出胶的位置。

  (三) 转膜

  1. 准备相应大小的一张 0.45 μm 或 0.22 μm PVDF膜(孔径根据目的蛋白分子量确定,低于 20 kDa 小分子可选择孔径小的膜)和四张滤纸,置于电转液中浸泡,PVDF 膜先于甲醇中活化。

  2. 翘开玻璃板剥胶于电转液中,洗去残留的电泳液,后小心置于电转夹上,不能有气泡,电转夹板黑色板(负极)置于下部,按照“海绵-滤纸-胶-PVDF 膜-滤纸-海绵”的顺序安装好,每一步都要避免气泡。

  3. 夹紧后放入电转槽中(电转槽预先放入加冰的塑料盆内),电转液加满并加冰块,295 mA 下转膜 1.5 h或 2 h(转膜时间依据目的蛋白分子量大小决定,大于 200 kDa 的蛋白可适当延长转膜时间)。

  (四) 洗膜

  电转完成后,将 PVDF 膜放进玻璃皿,用 TBST 溶液浸泡,放于摇床上 90 r/min*5 min,重复三次,洗去残留的电转液。

  (五) 封闭

  弃去 TBST 液,5% 脱脂牛奶浸泡 1 h,60 r/min。

  (六) 抗体孵育

  加一抗:将 PVDF 膜用 TBST 液浸洗三次,90 r/min* 5 min,根据目的蛋白及内参蛋白的分子量确定裁膜位置,装入抗体孵育袋,并加入适宜量的一抗溶液(2~3 ml为宜),小心封好,不要挤压 PVDF 膜,放入冰箱,4°C 过夜;

  加二抗:

  1. 过夜后取出,将抗体孵育袋放到摇床上恢复室温30 min,60 r/min,回收一抗。

  2. 将 PVDF 膜取出(注意镊子夹在膜的边缘位置),用 TBST 液浸洗三次,每次5~10 min,90 r/min。

  3. 将PVDF膜放入暗盒,加入带有荧光的二抗溶液,放置于摇床孵育 90 min,60 r/min。

  4. 结束后用 TBST 液浸洗三次,每次5~10 min,90 r/min。

  5. TBST液浸洗一次,5~10 min,90 r/min。

  (七)红外扫膜仪显影

  注意避光以及膜的整洁

本文链接:https://www.zjby-biotech.com/news/hyzx/1845.html

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