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WB实验代测的原理与基本过程

2022-12-05 10:30:15
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  Western免疫印迹(WesternBlot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

  WB实验代测原理:

  1、WB实验代测采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

  2、以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

  以上是小编为大家讲解的原理,那么小编接下来进一步讲解基本过程有哪些?

  WB实验代测基本过程:

  1、获取细胞或组织裂解物。

  2、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer。

  3、选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性。

  4、蛋白定量。

  5、电泳分离蛋白质。

  6、转膜:根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。

  7、封闭:去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。

  2、一抗孵育。


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