一、PCR引物设计目的

PCR引物设计的目的是寻找到一对合适的核苷酸片段，以确保其能够高质量地扩增模板DNA序列（目的基因）。因此，引物的质量对于PCR的特异性和实验的成功与否起着关键作用。

二、引物设计8大原则

原则1：确保引物的特异性

为确保PCR扩增的特异性，引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

原则2：选择合适的引物长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74°C），因此无法确保产物的特异性。

原则3：确保产物不会形成二级结构

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响。在选择扩增片段时，尽量避开二级结构区域。通过利用相关计算机软件判断mRNA的稳定二级结构，有助于优化模板的选择。

原则4：确保碱基的随机分布

在引物设计中，四种碱基的分布应保持随机性，避免出现聚嘌呤或聚嘧啶的现象。需特别注意，3’端连续的G或C数量不应超过3个，因为这样可能导致引物在G+C富集序列区发生错误引发。

原则5：确保G+C含量的合理性

G+C含量一般控制在40%~60%的范围内较为合适，其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度通常比Tm值高出5~10℃。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）计算引物的Tm值，则有效引物的Tm范围为55~80℃。为使复性条件达到最佳，引物的Tm值宜接近72°C。

原则6：确保引物自身/之间没有连续4个碱基的互补

引物自身不应存在互补序列，否则会形成自身折叠的发夹状结构。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。人工判断时，引物自身连续互补碱基不应超过3bp。

此外，还要确保两引物之间不存在互补，特别要注意避免3’端出现互补重叠，以避免引物二聚体的形成。同时，一对引物之间应控制连续碱基的同源性或互补性，不应超过4个。

原则7：引物5’端可修饰/3’端不可修饰

引物的5’端限定了PCR产物的长度，但对扩增特异性影响较小。因此，对其进行修饰并不会影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一小段启动子序列等。

引物延伸始于3’端，不能对其进行任何修饰。此外，3’端不应存在形成二级结构的可能性。除了在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生错配。

原则8：确保引物3’端避开密码子的第3位

引物的3’端应避开终止于密码子的第3位，因为密码子的第3位容易发生简并，这会对扩增的特异性和效率产生影响。