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流式细胞术检测制备基本流程

2022-10-28 10:32:39
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  流式细胞术检测的对象一般是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞,如果要检测组织中的细胞,则必须先将组织制备成单细胞悬液,而后方可进行检测。

  制备基本流程如下:

  1.细胞的培养、制备

  将一定数量的单个细胞收集于1.5mL的EP管中,2400rpm、4℃离心4min,弃上清;加入1xPBS清洗,同等条件进行离心,弃上清。

  2.封闭

  用来标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体,少数也可能是多克隆抗体,但其基本结构都是由两部分组成:包含有特异性结合抗原位点的Fab段、相对保守的Fc段。抗体的特异性表现在Fab段,标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子进行特异性结合,从而进行标记并且相对量化的展示了细胞表达该抗原分子的情况。

  3.荧光素偶联抗体标记

  以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例,一般染色体系推荐100μl,CD3、CD4表达量相对较高,1μl足够了,假如有9个样本,分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中,混匀后,分别取100μl加到9个样品孔中,混匀,室温、避光染色20min。时间到后加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体,2400rpm、4°C离心4min,弃上清,加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀,并尽快上机分析。

  4.光电倍增管电压的设定

  上机分析时,在确认机器没有问题后,需调节每个通道的光电倍增管的电压,从而区分细胞群,利用FSC和SSC,通过调节FSC和SSC的电压,区分淋巴细胞亚群,使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后还需调节APC-cy7、FITC的电压,使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。

  5.设置对照,补偿调节

  流式实验中对照设置很重要,常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。

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