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染色质免疫共沉淀操作方法(染色质免疫共沉淀原理及步骤)

2022-03-18 10:29:31
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  染色质免疫共沉淀实验·原理

  在保持组蛋白和DNA联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色质被切成很小的片断,并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

  染色质免疫共沉淀实验试剂· 器材

  试剂

  甲醛

  甘氨酸

  PBS

  SDS Lysis Buffer

  洗脱液

  RNaseA

  蛋白酶K

  omega胶回收试剂盒

  器材

  离心管

  超声仪

  电泳仪

  离心机

图例

  染色质免疫共沉淀操作方法

  一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)

  取出1平皿细胞(10cm平皿),加入37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9 ml)。37℃孵育10min。

  终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450μl 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

  吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。

  细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后1000rpm,离心5min,弃上清,12000rpm,离心1min,黄枪头套白枪头,将上清尽量弃净,收集细胞。

  倒去上清。按照细胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200μl含2x106个细胞。这样每100μl溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4x106个细胞。因此每管加入400μl SDS Lysis Buffer。将两管混在一起,共800ul

  超声破碎:VCX750,25%功率,4.5s冲击,9s间隙。共14次。

  二、除杂及抗体哺育(第一天)

  超声破碎结束后,10 000r/min 4℃离心10min。去除不溶物质。

  留取300ul做实验,其余保存于-80℃。

  300μl细胞中,100μl加抗体做为实验组;100μl不加抗体做为对照组;100μl加入4μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M),65℃处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

  在100μl的超声破碎产物中,加入900μl ChIP Dilution Buffer和20μl的50xPIC。再各加入60μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。

  1h后,在4℃静置10min沉淀,700 rpm离心1min。

  取上清。各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜(最低速度)。

  三、检验超声破碎的效果(第一天)

  取100μl超声破碎后产物,加入4μl 5M NaCl,65℃处理2h解交联。

  分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

  四、免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)

  孵育过夜后,每管中加入60μl Protein A 、Agarose/Salmon Sperm DNA,4℃颠转2h。

  4℃静置10min后,700 rpm离心1min。除去上清。

  依次用下列溶液清洗沉淀复合物。

  清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10min,4℃静置10min沉淀,700 rpm离心1min,除去上清。

  洗涤溶液:(1)low salt wash buffer-洗涤一次(2)High salt wash buffer-洗涤一次(3)LiCl wash buffer-洗涤一次(4)TE buffer-洗涤两次

  清洗完毕后,开始洗脱。

  洗脱液的配方:100μl 10%SDS,100μl 1M NaHCO3,800μl ddH2O,共1ml。

  每管加入250μl洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。

  重复洗涤一次,最终的洗脱液为每管500μl。

  解交联:每管中加入20μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2 M),混匀,65℃解交联过夜。

  五、DNA样品的回收与PCR分析(第三天)

  解交联结束后,每管加入1μl RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。

  每管加入10μl 0.5M EDTA,20μl 1M Tris.HCl(PH6.5),2μl 10mg/ml蛋白酶K。45℃处理2h。

  DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100μl ddH2O。

  PCR分析

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