资讯动态

哺乳动物细胞中制备核和细胞质提取物(细胞核提取步骤)

2022-03-20 10:42:25
|
访问量:123352

  从培养细胞中分离的细胞核制备的提取物能够在体外精确地转录并进行mRNA加工。因此这些提取物可以直接用于功能研究,并作为纯化这些过程所涉及的蛋白质的起始材料。

  01核提取物的制备

  材料

  转瓶或单层培养的哺乳动物细胞(如HeLa细胞)

  PBS

  低渗缓冲液

  低盐

  高盐缓冲液,含 1.2 mol/L KCI

  透析缓冲液

  液氮

  贝克曼JS4.2转子或相当的转子

  50 ml 圆锥形刻度聚丙烯离心管(对较小体积的提取物也可用 15 ml 的离心管)

  Dounce 氏玻璃匀浆器(B型研杵)

  BeckmanJA-20 离心转子或相当的转子

  磁性搅拌器或倾斜台

  管型透析膜(≤14 000 MWCO)

  电导计

  注意

  所有步骤的操作均在 0~4℃ 进行,在冷室内操作更好。缓冲液和设备要预冷。所有离心均在 4 ℃ 进行,转子要预冷。

  步骤

  1a)收集转瓶培养的细胞:将5X108~10X10细胞置1 L的塑料瓶1850 g离心20 min。轻轻倒去上清并丢弃,将细胞转入50 ml锥形刻度离心管中(每管 2~3 L 细胞)。进行步骤2。

  1b)收集单层培养的细胞:单层细胞长满后去掉培养液。用足量 PBS 洗 1 次,PBS用量为没过细胞,轻轻振荡,弃PBS。将细胞刮入新鲜PBS液里,倒进锥形刻度离心管中。进行步骤2。

  2)1850 g离心10min,进行步骤 3a。转瓶培养或步骤 3b 单层培养。

  3a)转瓶培养细胞:轻轻倒出上清并弃掉。用离心管上的刻度测量压紧后细胞的体积(pcv)。将细胞重悬于约 5 倍于其pev的PBS液中。1850 g离心 10 min。进行步骤4。

  3b)单层培养细胞:轻轻倒出上清并弃掉。用离心管上的刻度测量pev,进行步骤4。

  4)快速地将沉淀的细胞重悬于 5 倍体积的低渗缓冲液中。1850 g离心10 min并弃掉上清。

  5)将细胞沉淀重悬于 3 倍于原pcv的低渗缓冲液中,放置在冰上10 min,让细胞肿胀。

  6)将细胞转到Dounce氏玻璃匀浆器中,用 8 号研杵上下抽提 10 次。用台盼蓝染色排斥法在显微镜下检查细胞裂解情况(应大于80%~90%)。

  7)将细胞转到离心管中。用JS4. 2转子3300 g离心 15 min 收集细胞核。保留上清用来制备S -100细胞质提取物。

  8)用离心管上的刻度测量第 7 步离心压紧后的细胞核体积(pnv)。用 1/2 pnv 体积的低盐缓冲液重悬细胞核。

  9)在轻轻搅拌的同时,逐滴加入1/2 pnv体积(见步骤 8 )的高盐缓冲液。必要时用Dounce氏玻璃匀浆器匀浆。

  10)不断轻轻搅拌 30 min 以提取核内容物。

  11)用Beckman JA-20转子25 000 g离心30 min以收集核提取物。倒出上清并测量其电导率(见步骤12),这就是核提取物。

  12)将核提取物加入透析管中,用夹子至少封住透析袋的一端;在 50 倍体积的透析液中进行透析,直到提取物的电导率和透析液一致为止(即提取物的KCI浓度达到 100 mmol/L时)。尽量缩短透析时间。

  13)取 5~10 μl 提取物用水稀释至 1 ml 用来测电导。用电导测量仪直接读出稀释液的电导值,与同样稀释的透析液的电导值相比较。

  14)将提取物从透析袋中移出,最后一次检测其电导率以确定透析已经完成。将提取物 25000 g离心 20 min,弃掉沉淀。

  15)测定上清中蛋白质浓度。根据需要分装,浸人液氮中速冻,-80℃ 保存。

  02细胞核提取方法的优化

  本方案介绍了在制备不同类型细胞的核提取物的过程中,或在转录、剪接及迁移率变动分析等应用中,一种优化盐浓度的简单方法。

  附加材料

  高盐缓冲液,分别含0.8、1.0、1.2、1.4 及1.6 mol/L KCl

  步骤

  1)按上述方案中步骤 1~8 操作。

  2)在低盐缓冲液中重悬细胞核后(1/2 体积pnv)将细胞核悬液分成 5 等份。

  3)在冷室内不断搅拌,按如下方法在每份悬液中加人 1/3 体积高盐缓冲液:在第1份中加 KCl 浓度最低(0.8 mol/L)的高盐缓冲液,其余各份中依次加入 KCI 浓度逐渐增高(直到1. 6 mol/L)的高盐缓冲液。

  4)确定在离心管斜面上有提取出的细胞核,轻轻混合30 min。

  5)25000 g 离心 30 min ,除掉核。

  6)将上清轻轻倒出,进行透析,直到加 KCI 浓度最高的那份核悬液的电导率达到与透析液一致(100 mmol/L KCI)。提取物25 000 g 离心 20 min。

  7)检测各份提取物的电导率并测定蛋白质浓度。

  8)直接分析提取物或分装到试管中,在液氮中速冷后放人-80°C 保存。

  03细胞质[S-100]组分的制备

  附加材料

  细胞质提取物

  10X细胞质提取缓冲液

  Beckman50型固定角转子或相当的转子

  步骤

  1)仔细测量细胞质提取物的体积。加入 0.11 倍体积的 10× 细胞质提取缓冲液,充分混合。

  2)100000 g 离心 1 h。

  3)将上清(S-100)装入透析管中进行透析,直至 S-100 的电导率达到与透析缓冲液一致(KCl 100 mmol/L)。

  4)从透析管移出S-100,25 000 g 离心 20 min,以收集沉淀组分。

  5)轻轻倒出上清,检测其电导率并测定蛋白质浓度。分装入小管中,液氮中快速冷冻,-80°C 保存。

  • 业务咨询

    业务咨询专线:133 7682 0615

    Email:lxyjy@wie-biotech.com

在线留言×