化学发光免疫分析技术是将化学发光分析技术和免疫反应相结合的一种新型超微量分析技术。该技术具有发光分析的高度灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性。

化学发光免疫分析技术(化学发光免疫分析步骤)

　　实验原理

　　化学发光酶免疫测定是采用化学发光剂作为酶反应底物的酶标记免疫测定。经过酶和发光两级放大，具有高度灵敏性和特异性。利用两种抗相同抗原的单克隆抗体，其中一种包被到固相载体上，另一种用酶标记制备成酶标抗体。向固相载体中滴加待检样品，若样品中含有相应抗原，则抗原与包被的固相抗体相结合。洗涤后，加入酶标记抗体。洗涤后，加入发光底物溶液，在酶的催化作用下，产生发光反应，使用酶促化学发光免疫分析仪检测酶促化学发光的强度，根据标准曲线可实现对待测样品的定量分析。

　　试剂·耗材

　　包被液 0.05 mol/L pH 9.6 碳酸钠–碳酸氢钠 缓冲液。

　　洗涤液 PBST：PBS-Tween-20。

　　样品洗涤液 PBS- 1% BSA。

　　HBsAg 化学发光酶免疫测定试剂盒包被抗体、辣根过氧化物酶标记抗体和阳性标准品。

　　底物溶液 AMPPD 溶液。

　　样品待检血清。

　　其他仪器酶促化学发光免疫分析仪、培养箱、96 孔聚苯乙烯板、微量加样器、湿盒、吸水纸等。

　　实验步骤

　　包被利用包被液稀释包被抗体，向 96 孔聚苯乙烯板内每孔加入100 μl，置于湿盒中，37 ℃ 孵育 2 h 或 4℃ 过夜。

　　洗涤取出反应板，弃去孔内液体，每孔加洗涤液300 μl，洗涤1 min，于吸水纸上充分拍干。重复洗涤3次。

　　加入待检样品和阳性标准品用样品稀释液做不同倍数稀释 HBsAg 阳性标准品或待检血清，于每孔中加入100 μl，同时设定一个空白对照孔（(加洗涤液100 μl)，置于湿盒中，37℃ 孵育1 h。

　　洗涤同步骤2。

　　加入酶标抗体用样品稀释液将酶标抗体稀释只工作浓度(按说明书)，加入反应孔中，每孔100 μl，置于湿盒中，37℃ 孵育1 h。

　　洗涤同步骤2。

　　加入底物溶液每孔加入 AMPPD 溶液500 μl，室温避光反应30 min。

　　化学发光测定将反应板放置于酶促化学发光免疫分析仪中，检测化学发光强度。

　　结果分析

　　以不同稀释倍数的HBsAg阳性标准品的化学发光强度作为纵坐标，不同稀释倍数为横坐标，做出标准曲线，待测样品中HbsAg的含量可由测量的化学发光强度代入标准曲线换算得到。

　　正常人HBsAg参考范围为0~0.5 μg/L，待检样品中HBsAg若高于该参考范围，即为阳性。