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细胞凋亡实验原理分享

2022-10-28 10:38:52
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  细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

  在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。

  在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为 180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电泳,可显示以 180-200bp 为基数的 DNA ladder(梯状带纹)的特征。

  相比之下,坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核 DNA 虽也降解,但由于存在各种长度不等的 DNA 片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。

  一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

  三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明 HT 在 0.02~5μg/ml 范围内作用 2 小时,即可诱导 HL-60 细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用 1μg/ml HT 在体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342 和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

  细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI 就进入细胞内部,它可嵌入到 DNA 或 RNA 中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。Hoechst33342 是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA 特异结合(主要结合于 A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。


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