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细胞的冻存和复苏操作步骤

2023-03-17 10:37:25
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  一、原理

  在不加条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

  细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。

  目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。

  二、操作步骤

  (一)冻存

  1、消化细胞,将细胞悬液收集至离心管中。

  2、1000rpm离心10分钟,弃上清液。

  3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。

  4、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。

  5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口要严,否则复苏时易出现爆裂。

  6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

  7、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。

  注意:操作时应小心,以免液氮**。液氮定期检查,随时补充,不能挥发干净,一般30立升的液氮能用1~1.5月。

  (二)复苏

  1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装2/3杯37℃的温水。

  2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。

  3、打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中。

  4、1000rpm离心10分钟,弃去上清液。

  5、沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10分钟,弃上清液。

  6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中,37℃培养,**天观察生长情况。

  三、试剂和器材

  器材:液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机等

  试剂:0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基(即冻存液)

  附:冻存液配制:

  培养基加入甘油或DSMO,使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。


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