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细胞周期同步化几种常用的方法

2023-03-17 10:25:12
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  在一般培养条件下,群体中的细胞处于不同的细胞周期时相之中。为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡,故常需借助某种自然或人工的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象,这就是细胞同步化技术。

  由于细胞群体受到多种条件限制,对结果有很大影响,所以一般采用人工同步方法,下面就来介绍几种常用的方法。

  M期同步化法

  01振荡收集法

  该法利用M期细胞变圆易脱落的特点,将生长旺盛的贴壁细胞按一定的时间间隔振荡,使M期细胞脱落,逐步收集培养基,并补充新的培养基。按照此法继续收集,可得到一定数量的M期细胞。

  优点:方法简单,同步化程度高且不受药物伤害,能够真实反应细胞周期状况;

  缺点:由于M期较短,得到的细胞很少,并且只适用于贴壁细胞。

  02秋水仙素阻抑法

  秋水仙素可以抑制微管聚合,因而能有效地抑制细胞纺锤体的形成,将细胞阻断在细胞分裂中期。此方法也比较简单,将细胞培养至指数生长期,加入秋水仙素,使培养基最终浓度为0.25~0.5μg/mL,作用6~7min,收集细胞800r/min离心5~10min,弃上清,沉于管底的细胞即为M期细胞。

  注意:由于秋水仙素对细胞有一定毒性,用量较小或作用时间较短时细胞活性尚可恢复,而用量过大或时间过长则细胞不能存活,因此使用时应严格控制其剂量和作用时间。

  03N2阻断法

  细胞培养至指数生长期后将培养瓶置于N2罐中并通适量CO2 ,约相当于罐中体积的5%。关闭好N2罐,接上N2管子及压力表,缓缓向罐中充气一直到压力为80~90磅/英寸为止。将N2装置放在37℃培养箱中10~16h(通常过夜)。次日从培养箱中取出,然后缓缓将N2放出。取出细胞在镜下观察同步化效果,用振荡法收集细胞于离心管中。800r/min离心10min收集细胞。

  优点:此方法较秋水仙素阻抑法好。

  S期同步化法

  01胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法

  胸腺嘧啶核苷(TdR)是一种DNA合成可逆抑制剂(阻断S期,去除后S期可继续进行)。为了加强细胞同步化效果,常采用两次TdR阻断法,即双阻断法。

  第1次阻断时间比S期长但短于G2、M、G1三期总和,让它们越过S期,但又不使按周期发展最快的细胞进入下一个S期。第2次阻断时间同第1次,再释放。

  下面以HeLa细胞为例加以说明(HeLa细胞周期时间为21h,其中G1期为10h,S期为7h,G2期为3h,M期为1h)。

  1细胞培养:将细胞培养至指数生长期;

  2第一次阻断:培养基换成含2mmol/L的新鲜TdR培养基(2~2.5mmol/L用于肿瘤细胞的同步化培养,而CHO细胞则用7mmol/L TdR),二氧化碳培养箱中培养12h;

  3第一次释放:弃去含TdR培养基,缓冲液漂洗2~3次,并更换不含TdR的新鲜培养基,二氧化碳培养箱中培养16h;

  4第二次阻断:重新加入TdR培养基(浓度同上)进行再次阻断,培养12h;

  5第二次释放:同步骤3,此时的细胞大部分出去G1/S期边界,同步化细胞随时间推移逐渐进入S期。

  注意:具体TdR作用和释放的时间应参考每一种待同步化细胞的细胞周期各时相测定的参考值,也可根据经验确定。

  G2、G1和G0期细胞获取

  01获取G2期细胞

  根据细胞周期测定的数值,采用TdR双阻断法使细胞同步在G1/S期交界处后,洗去TdR使细胞释放后继续培养。其培养时间应大于S期时间而小于S+G2期时间。然后先用振荡法使已进入M期的细胞脱落,弃去上清培养基;再用胰酶消化,加入新鲜培养基制成细胞悬液,离心收集细胞,即为G2期细胞。

  02获取G1期细胞

  方法1:将用M期阻断法获得的细胞加入一定量的培养基,继续培养1~10h即可获得各阶段的G1期细胞。

  方法2:用缺乏异亮氨酸的培养基培养细胞,培养时间超过一个细胞周期,即可获得中G1期细胞。

  03获取G0期细胞

  采用血清饥饿法:

  1取处于对数生长期的细胞;

  2用无血清的培养基培养24h,注:有时候完全去掉细胞发生死亡,因此可以尝试用含0.5%-1%小牛血清的培养基培养细胞48~72h;

  3用胰蛋白酶消化细胞即可收获G0期细胞。

  注意事项:

  为了提高同步化效率,也可将几种同步化方法结合使用。如用N2阻断法进行M期细胞同步时,可先将对数生长期细胞用2.5mmol/L TdR处理一段时间,更换新鲜培养基并释放一段时间后,装入N2罐中,这样处理可进一步提高M期细胞同步率;

  一般所有同步化法对细胞的生理活动都会产生一定的影响,因此在选用某一方法时应先了解该方法的作用机理,优选对实验目的影响小的方法;

  收集到的有丝分裂期的细胞可以贮存在冰上,然后处理其余的培养瓶。

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